2017 Fiscal Year Annual Research Report
Functional and structural analyses of iterative type I polypektide synthases
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17H03995
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| Research Institution | Iwate Medical University |
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Principal Investigator |
藤井 勲 岩手医科大学, 薬学部, 教授 (70181302)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | ポリケタイド / ポリケタイド合成酵素 / 生合成 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ポリケタイド化合物の骨格生成を担う繰返しタイプＩ型ポリケタイド合成酵素（iPKS）における反応制御機構、三次元構造の解明を目指し、ベースとなる最小iPKSの構築と発現を中心に検討した。
Emericella variecolor由来のtriacetic acid lactone合成酵素（TALS）を最小iPKSを構築するベースとして、これを出芽酵母S. cerevisiaeやPichia酵母をホストとして発現させるため、Web toolを用いてイントロンの予測を行ったところ、１ヶ所もしくは２ヶ所のイントロンの存在が推定された。それぞれに対応したプラマーを設計し、エクソン部分を増幅後、予想cDNAを構築した。また、酵母でiPKSを活性型として発現させるため、A. nidulans由来のnpgA遺伝子を酵母に組み込んだpAUR-npgAを構築した。これをS. cerevisae BJ5464株のゲノム中にインテグレーションさせたiPKS発現用宿主Sc BJ5464/npgAを構築した。本宿主中でnpgAが機能し、iPKSが活性化されてPKS産物が生産されることをA. fumigatusのナフトピロン合成酵素遺伝子alb1を発現させることにより確認した。次いで、TALSの予想cDNAを酵母発現ベクターに組み込んだpYES-54P2などをSc BJ5464/npgAに導入し、誘導培養後、生産化合物の確認を行ったが、残念ながらTALの生産は確認できなかった。現在、A. oryzaeでTALSを発現している株からcDNAを取得し、酵母での発現をさらに検討している。
もう１つのベースiPKSとして予定している6-methylsalicylic acid合成酵素については、既に大腸菌での発現系を構築、精製酵素の調製を行っており、クライオ電子顕微鏡による三次元構造の解析に進める予定である
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
ポリケタイド化合物の骨格生成を担う鍵酵素である繰返しタイプＩ型ポリケタイド合成酵素（iPKS）における反応制御機構、三次元構造の解明を目指すためのベースとなるiPKSとして選択したTALSについて、その予想cDNAをiPKS発現用宿主として構築したS. cerevisae BJ5464株で発現させ、その活性型としての発現を検討したが、残念ながら予想したイントロンを除いて構築したcDNAでは生産産物であるtriacetic acid lactoneを確認することができなかった。一方、よりドメイン数の多いナフトピロン合成酵素遺伝子alb1のcDNAが本宿主中で機能していることから、TALSのcDNAをmRNAより調製し、イントロンを確認すれば、機能的な発現は可能であると考えている。もう１つのベースiPKSであるMSASについては、精製酵素の調製を進めており、準備ができ次第、クライオ電子顕微鏡による三次元構造の初期解析へと進める予定であり、新規のtagを利用したアフィニティー精製がうまく機能すれば、最小iPKSだけでなく、ドメイン数の多い他のiPKSの発現、精製、構造解析を進めることが可能であると考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
昨年度に引き続き、下記の計画で研究を進める。
【１】最小iPKSの構築と発現として、TALSをさらに最小化するため、１ACPのSAT-KS-AT-ACPドメイン構成の変異体を構築し、その機能を確認する。機能を確認したmini-TALS遺伝子を酵母発現系などに導入して活性タンパクの高発現を検討する。
【２】酵母でmini-TALSを活性タンパクとして発現に成功できれば、tagを付加体として発現させ、精製を試みる。今年度は、C末ID-4 tag付加体の発現と精製、大量調製を試みる。
【３】mini-TALSおよびMSASについて、精製タンパクを用いて、クライオ電子顕微鏡による構造解析の初期検討を行う。
【４】iPKS高発現系の開発として、今年度は酵母Kluyveroyces lactisをホストとするiPKSタンパク高発現系の開発を検討する。npgAを組み込んだ発現プラスミドを作製し、K. lactisに導入後、iPKSの発現カセットで形質転換して発現株を得る。まず、MSAS、TALSやmini-TALSについて検討し、高発現系が機能するかどうかを検討する。高発現が確認できれば、申請者がこれまでに手がけてきたWA、PKS1、PKSN、Sol1、ShmAなどの各種NR-PKS、HR-PKSについて、その発現を検討する。さらに、ID-4 tag付加などによるアフィニティー精製など、効率的な精製方法の確立を検討する。機能的発現や高発現が認められない場合は、分泌型、非分泌型、適切なプロモーター、最適コピー数など発現条件を種々検討する。
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