2018 Fiscal Year Annual Research Report

Functional and structural analyses of iterative type I polypektide synthases

Research Project

Project/Area Number	17H03995
Research Institution	Iwate Medical University
Principal Investigator	藤井勲岩手医科大学, 薬学部, 教授 (70181302)
Project Period (FY)	2017-04-01 – 2022-03-31
Keywords	ポリケタイド / ポリケタイド合成酵素 / 生合成
Outline of Annual Research Achievements	繰返しタイプＩ型ポリケタイド合成酵素（iPKS）における反応制御機構、三次元構造の解明を目指し、ベースとなる最小iPKSの構築と発現を中心に検討した。 E. variecolor株由来のtriacetic acid lactone合成酵素（TALS）を最小iPKSを構築するベースとするため、引き続き出芽酵母S. cerevisiaeでの発現について検討した。予測cDNAでは発現が確認できなかったため、TALSを発現させたA. oryzae形質転換体からcDNAを取得し、イントロンを確定したところ、イントロンは１ヶ所で昨年度予測したものの一つと一致した。そこで、再度、iPKS発現用宿主Sc BJ5464-npgAでの発現を試みたがTALの生産は認められなかった。その原因として、A. nidulans由来のnpgAがTALSを認識しない可能性を考え、TALSが発現しているA. oryzaeよりそのphosphopantetheine転移酵素遺伝子を検索し、npgAと45％相同性を示すapt遺伝子を見出した。aptがSc BJ5464株で機能し、iPKSが活性化されてPKS産物が生産されることをA. fumigatusのナフトピロン合成酵素遺伝子alb1を発現させることにより確認した。次いで、Sc BJ5464株でTALSとaptを共発現させて、TALの生産を検討したが、残念ながら生産を確認するには至らなかった。そこで、5’-UTR配列、プロモーターなど種々の検討を試みたが、TALの生産は確認されなかった。現在、TALSとは独立した生産物遊離酵素の関与を想定し、その検索と機能確認を検討している。既に酵母等での発現に成功しているiPKSについては、順次精製酵素を調製し、クライオ電子顕微鏡による三次元構造の解析に進める予定である
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason ポリケタイド化合物の骨格生成を担う鍵酵素である繰返しタイプＩ型ポリケタイド合成酵素（iPKS）における反応制御機構、三次元構造の解明を目指すためのベースとなるiPKSとして選択したTALSについて、cDNAを確認し、酵母S. cerevisae BJ5464株での発現を種々検討したが、現在のところ、TAL生産の確認には至っていない。このTALSを最小iPKSのベースとする予定であったため、研究の進展が遅くなっている。
Strategy for Future Research Activity	昨年度に引き続き、下記の計画で研究を進める。【1】iPKS高発現系の開発については、出芽酵母S. cerevisae BJ5464株に昨年度麹菌A. oryzae中に見出したphosphopantetheine転移酵素の遺伝子であるaptを組み込んだ発現用酵母宿主を構築する。次いで、MSASやalb1などのiPKS遺伝子を高発現プロモーター下に導入した発現プラスミドをSc BJ5464-apt株に導入し、高い化合物生産およびタンパク発現が可能かどうかを検討する。高発現が確認できれば、これまでに手がけてきたPKS1、PKSN、Sol5、ShmAなどの各種NR-PKS、HR-PKSについて、その発現を検討する。さらに、各種tag付加などによるアフィニティー精製など、効率的な精製方法の確立を検討する。【2】最小iPKSの構築と発現については、E. variecolor GF10株のtriacetic acid lactone（TAL）合成酵素（TALS）の酵母での高発現が確認できれば、これをさらに最小化するため、１ACPのSAT-KS-AT-ACPドメイン構成の変異体を構築し、その機能を確認するとともに、最小PKS mini-TALSタンパクの高発現を検討する。【3】最小iPKSの精製では、酵母でmini-TALSを活性タンパクとして髙発現を試み、tag付加体などとして発現させ、精製を行い、大量調製を試みる。【4】クライオ電子顕微鏡による構造解析の検討については、精製ができたiPKSについて、精製タンパクを用いて、クライオ電子顕微鏡による構造解析の初期検討を行う。