2019 Fiscal Year Annual Research Report
Functional and structural analyses of iterative type I polypektide synthases
| Project/Area Number |
17H03995
|
|---|
| Research Institution | Iwate Medical University |
|---|
Principal Investigator |
藤井 勲 岩手医科大学, 薬学部, 教授 (70181302)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2022-03-31
|
| Keywords | ポリケタイド / ポリケタイド合成酵素 / 生合成 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
繰返しタイプＩ型ポリケタイド合成酵素（iPKS）における反応制御機構、三次元構造の解明を目指し、下記の研究を中心に検討した。
E. variecolor株由来のtriacetic acid lactone（TAL）合成酵素（TALS）を最小iPKSを構築するベースとするため、出芽酵母S. cerevisiaeでの発現について検討した。GAL1系プロモーターをADH2プロモーターに変更し、発現プラスミドを構築、発現用宿主Sc BJ5464-npgAに導入し、誘導培養を行ったところ、TALの生産を確認することができた。そこで、ATXのKS部分をTALSのSAT-KS部分と置き換えたキメラ体を構築し、現在、その機能解析を進めている。
また、還元型iPKSとして、shimalactone生合成のShmA PKSについて、ADH2プロモーターを用いた酵母発現について検討したところ、Sc BJ5464-npgAでの誘導発現によりpreshimalactoneの生産を確認することができた。そこで、preshimalactoneをepoxideに変換すると予想したShmBをADH2プロモーター下、ShmAとともにSc BJ5464-npgAで共発現させた。その結果、一気にshimalactoneが生産すること、shimalactone AとBの比率が約4:1と生産菌E. variecolorと同じであることを確認した。これは、ShmBにより生成したpreshimalactone epoxideからoxabicyclo環の生成と続く8π-6π電子環状反応が非酵素的に進行した結果と考えられた。この新規ダブルビシクロ環化反応について計算化学的に検討し、これが非酵素的に進行し得ることを明らかにした。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
ポリケタイド化合物の骨格生成を担う鍵酵素である繰返しタイプＩ型ポリケタイド合成酵素（iPKS）における反応制御機構、三次元構造の解明を目指すため、酵母S. cerevisae BJ5464株での発現を種々検討した結果、A. nidulansのphosphopantetheine転移酵素遺伝子npgAを組み込んだS. cerevisae BJ5464-npgAを宿主とし、発現プロモーターとしてADH2を用いることにより、これまで機能的発現を確認することができなかったが、triacetic acid lactone（TAL）合成酵素（TALS）についてTALの生産を確認することができた。同様に還元型iPKSとして酵母での発現を検討したshimalactone生合成のShmA PKSについても、その発現によるpreshimalactoneの生産を確認し、反応制御機構および三次元構造解明のための基盤を築くことができた。これを足掛かりとして、少し遅れがちであった研究の進展をペースアップする予定である。
|
| Strategy for Future Research Activity |
今年度は昨年度の成果を元に下記の計画で研究を進める。
【1】iPKS高発現系の開発： 昨年度、出芽酵母S. cerevisiae BJ5464株にA. nidulansのphosphopantetheine転移酵素遺伝子npgAを組み込んだ発現用酵母宿主を用いて、還元型iPKSであるShmAの発現に成功したことから、これをベースとして、申請者がこれまでに手がけてきたPKS1、PKSN、Sol5などの各種還元型iPKSについて、その発現を検討する。また、MSASやAlb1pなどの芳香族型iPKSタンパクの高発現についても検討する。高発現が確認できれば、各種tag付加などによるアフィニティー精製など、効率的な精製方法の確立を検討する。
【2】最小iPKSの構築と発現： Emericella variecolor GF10株のtriacetic acid lactone（TAL）合成酵素（TALS）について、酵母での高発現が確認できれば、これをさらに最小化するため、１ACPのSAT-KS-AT-ACPドメイン構成の変異体を構築し、その機能を確認するとともに、最小PKS mini-TALSタンパクの高発現を検討する。
【3】最小iPKSの精製： 酵母でmini-TALSを活性タンパクとして髙発現に成功できれば、tagを付加体として発現させ、精製を試みる。各種tag付加体の発現と精製タンパクの調製を試みる。
【４】クライオ電子顕微鏡による構造解析の検討： 高発現し、精製ができたPKSについて、クライオ電子顕微鏡による構造解析の検討を行う。
|
