2021 Fiscal Year Annual Research Report
Functional and structural analyses of iterative type I polypektide synthases
| Project/Area Number |
17H03995
|
|---|
| Research Institution | Kitasato University |
|---|
Principal Investigator |
藤井 勲 北里大学, 薬学部, 客員教授 (70181302)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2022-03-31
|
| Keywords | ポリケタイド / ポリケタイド合成酵素 / 生合成 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
繰返しタイプＩ型ポリケタイド合成酵素（iPKS）における反応制御機構、三次元構造の解明を目指して、これまでに酵母S. cerevisae BJ5464株での発現を種々検討し、酵母でのiPKSの機能的発現を確認することができたものの、タンパク発現量が低く精製は困難であった。目的とするiPKSの精製、３次元構造の解明のためにはタンパク発現量の高い麹菌A. oryzaeの発現系を用いるべきであると判断し、シマラクトン生合成のiPKSであるShmAタンパクの発現、精製について検討した。麹菌での発現では、効率的5' UTRと改良プロモーターを有する大関株式会社の麹菌発現系を用いた。5' UTR直後にshmA cDNAを挿入し、C-末にlinkerを介してHis6-tagを付加するようデザインした発現プラスミドを構築した。これをA. oryzae NS4株にプロトプラスト-PEG法で形質転換・導入した。得られた形質転換株について、発現カセット遺伝子の増幅確認、抽出タンパクのSDS-PAGEとウェスタン解析による選抜後、単胞子分離により高発現株を純化した。最終的に選抜したA. oryzae/shmA-cHis形質転換株は2コピーの発現カセットがゲノムに挿入されていた。この形質転換株を2X DPY培地で24時間振盪培養した菌体より、20% glycerolを含む抽出バッファーで抽出して粗酵素液を調製し、C末に付加したHis6-tagを利用した精製について検討したところ、Ni-NTA resinにより精製できることが確認された。また、精製ShmAを用いて in vitro反応でpreshimalactoneが生成することを確認した。この精製ShmAを濃縮後、Crystal Screen IおよびJCSG-plusを用いた結晶化条件のスクリーニングを実施しているが、現在のところ、結晶は得られていない。今後、結晶化条件が確立できれば結晶構造解析へと進める予定である。また、結晶化が困難な場合は、クライオ電子顕微鏡による解析へと進めていきたいと考えている。
|
| Research Progress Status |
令和3年度が最終年度であるため、記入しない。
|
| Strategy for Future Research Activity |
令和3年度が最終年度であるため、記入しない。
|
