2017 Fiscal Year Annual Research Report

ゲノム編集による改良型ウイルス感染宿主細胞の構築

Research Project

Project/Area Number	17H04003
Research Institution	National Institute of Infectious Diseases
Principal Investigator	花田賢太郎国立感染症研究所, 細胞化学部, 部長 (30192701)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	齊藤恭子国立感染症研究所, 細胞化学部, 主任研究官 (70235034) 佐久間智理国立感染症研究所, 細胞化学部, 研究員 (80782888)
Project Period (FY)	2017-04-01 – 2021-03-31
Keywords	宿主細胞 / Vero細胞 / ゲノム編集 / フラビウイルス / 内在性レトロウイルス / ワクチン / レギュラトリーサイエンス
Outline of Annual Research Achievements	本課題ではゲノム編集技術を駆使して、フラビウイルスの感染増殖性が更新した改良型培養細胞の構築を目指している。黄熱ウイルスレプリコンを利用して、同ウイルスの複製能が更新した細胞を構築する試みについては、計画通り、主要ツールとなる同ウイルスレプリコンの作製を完了した。すなわち、既報を参考に黄熱ウイルスYF17D株ゲノムRNAを基にして、同ウイルスのサブゲノミックレプリコンcDNAを得た。これをプラスミドに組み込み、in vitro転写反応でサブゲノミックレプリコンRNAを作製することができた。ルシフェラーゼまたは蛍光タンパク質をレポーター遺伝子として発現するレプリコンを作製し、YF17D複製能をモニターする系を確立した。一方で、多様なウイルスに感受性の高いVero細胞において継代歴の異なる3細胞亜株（JCRB0111, ATCC CCL81, Vero 76）の全ゲノム配列を決定し、その比較解析した。その結果、Vero細胞ゲノムの83か所にsimian endogenous type D retrovirus（SERV）が挿入されており、これら挿入箇所は三細胞株で一致していることを見出した。また、特異的なPCRプライマーが設計可能であった12個の挿入SERVをVero細胞ゲノムから回収してそれぞれ単独に配列決定を行ったところ、その2つは完全長の無傷SERV配列を持っていた。これらの結果から、Vero細胞の樹立以降、当該細胞ゲノム中のSERVは、通常の継代培養をしている限りレトロトランスポーズしていないことが明らかになったとともに、SERVに由来する感染性粒子がVero細胞を基材として生産されたワクチン、特に生ワクチンに混在しないよう留意すべきことも示唆された。また、自然免疫経路を遮断してウイルス生産性を向上させることを意図し、ゲノム情報をもとにしていくつかの自然免疫経路系遺伝子ノックアウトしたVero細胞変異株をゲノム編集により作製した。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 既報を参考に黄熱ウイルスYF17D株ゲノムRNAを基にして、同ウイルスのサブゲノミックレプリコンcDNAを得た。これをプラスミドに組み込み、in vitro転写反応でサブゲノミックレプリコンRNAを作製することができた。ルシフェラーゼまたは蛍光タンパク質をレポーター遺伝子として発現するレプリコンを作製し、YF17D複製能をモニターする系を確立した。Vero細胞のゲノム中にはSERVの配列が挿入されている。Vero細胞においてトランスクリプトーム解析を行ったところ、DNAのメチル化阻害によりSERV遺伝子の転写が強く誘導された。また、3株のVero細胞亜株のゲノムを比較した結果、Vero細胞ゲノム中の84カ所にSERV配列が挿入されており、1カ所を除いては3株間で挿入位置が一致していた。さらに、12カ所のSERV配列をPCRにより増幅し配列を決定したところそれぞれの配列も3株間で完全に一致していた。配列を決定した12個のSERVのうち2個は完全長のSERVであることが明らかとなった。Vero細胞のゲノム情報をもとに、自然免疫系の細胞内シグナル伝達分子を標的としたsingle guide RNA（sgRNA）を設計した。このsgRNAとCRISPR/CAS9システムを用いてノックアウト細胞を作製することができた。
Strategy for Future Research Activity	黄熱ウイルスYF17Dレプリコンに関しては、適切なコントロールの作製と条件検討を行い、当該レプリコンを用いた同ウイルスの複製に関与する因子のゲノム編集技術によるスクリーニング系構築を目指す。一方、Vero細胞に関しては、作製したノックアウト細胞のJEV増殖性を親細胞と比較する。また、Vero細胞ゲノムに見出された全長SERVのプロウイルスDNAのクローニングを行い、同遺伝子の複製能とウイルス粒子形成能を検出する実験系の構築を試みる。