2017 Fiscal Year Annual Research Report
Studies on a novel regulatory mechanisms for neurotransmission through controlling the morphology of spine neck
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17H04014
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
佐藤 真 大阪大学, 連合小児発達学研究科, 教授 (10222019)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
岡 雄一郎 大阪大学, 連合小児発達学研究科, 講師 (30614432)
TIONG Sheena 大阪大学, 連合小児発達学研究科, 特任講師(常勤) (80771815)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 細胞機能形態学 / 解剖学 / 神経科学 / 脳・神経 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
学習の細胞基盤の一つはシナプス後部位のスパイン（棘突起）の形態変化並びにシナプス面に局在する受容体数変化である。そして、形態変化としては、主にスパイン頭部の容積変化およびシナプス面の面積変化が報告されてきた。一方、我々はスパイン基部（頚部）の形態が従来の想定よりも細い場合が多く、その変化がシナプス伝達効率に大きく影響する可能性を示唆するデータを得た。すなわち、スパイン基部を樹状突起とスパイン頭部間の受容体分子の通り道ととらえ、その基部が細ければ受容体分子などの移行は大きく阻害され、太ければ容易に移動し、その形態制御が神経情報伝達の効率に重要であるとの仮説に至った。本研究では、この仮説を実証し、従来顧みられなかったスパイン基部（頚部）に焦点をあて、その形態制御の分子基盤を解明し、スパイン基部による神経情報伝達制御という新たな概念を確立することが、本研究の目的であり、以下の点において実験を展開した。
実験１ スパイン基部形態の観察法の確立
実験２ シナプスでの情報伝達を担う分子のスパイン移入、および移出の動態観察法の確立
実験３ スパイン基部形態へのミオシンIIの役割の検討
実験１については、新たなベクターシステムを開発し確立することができた。実験２については想定していた観察法を確立することができた。実験3については、現在も実施中である（もともと、2年間にわたる実験実施を予定していた）。詳細は、８.現在までの進捗状況の項に記した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
実験１について。スパインの形態研究において、近年用いられることの多いラピッドゴルジ法では、必ずしもその形態が正確には再現できない。また、電子顕微鏡での観察像からスパインを再構築する方法は、確実ではあるが、同一スパインを時間を追っての観察ができないこと、および手技が煩雑である。一方、通常のGFP発現遺伝子の導入によるスパインの可視化では、例えば培養神経細胞の観察を行う場合、遺伝子導入される細胞が多くなりがちである。そのため、特定の神経細胞のスパイン像を一本の樹状突起にわたって観察することが困難である。ところが、導入遺伝子の濃度を下げると、蛍光強度が落ちがちであり、十分な観察が難しい。そこで、今回、新たに細胞ごとの蛍光強度を落とすことなく、低頻度に細胞を標識できる方法を開発した。具体的にはCreを発現すると、いわゆるpositive feedbackにより自己のCreを増やすことができるベクターを開発し、濃度を薄くして神経細胞に導入したところ、当初の目的が達成された。
実験２について。スパインから樹状突起への移入、もしくは樹状突起からスパインへ移出する分子の可視化をFRAP法（光褪色後蛍光回復法)もしくはPhoto-activation法（光活性化法）にて検討した。さらに我々は、スパイン ⇔ 樹状突起間 の分子移動に、フォスファチジルイノシトール３リン酸が重要な役割を担うこと、その際、フォスファチジルイノシトール３リン酸に、高い感受性で結合する特定の分子（分子は同定済み）が重要であることを見出しており、グルタミン酸受容体のサブユニットに加え、この分子の動態（移動速度）とスパイン基部の形態の相関について検討を行い、特にシナプス後部をつくるPSD-95の動態を決める要素の一つであることを確認した。
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| Strategy for Future Research Activity |
実験３を継続して実施する。ミオシンIIに強く結合し、その活性（ATPase活性）を阻害する働きのある分子を同定しているが、この分子は、海馬錐体細胞に明瞭に発現する。同細胞を例としミオシンIIの活性制御を試み、その役割を検討する。さらに、以下の実験を開始する。
実験４ 細胞内情報伝達系によるミオシンIIの結合活性の変化
予備実験では、我々の同定した分子とミオシンIIの結合は、細胞内情報伝達系、特にsmall G蛋白であるRhoにより制御された。海馬の錐体細胞では、内在的にLUZP1が発現しているため、ミオシンIIの活性が抑制されていると考えられる。LUZP1類似のFilip分子では、両者の結合は、small G蛋白により制御される（未発表）。そこで、LUZP1とミオシンIIの結合に対し、small G蛋白がどのように作用するか検討する。
実験５ スパイン頭部の活性化によるスパイン基部の変化の検討
スパインでの活性化（すなわちシナプス脱分極）により、スパイン基部の形態に変化が生じるか検討する。脱分極によりRho familyの一部の分子が活性化され、スパイン頭部の肥大化をもたらすことが既に報告されている。LTPの際の神経情報伝達の効率的上昇のためには、シナプス面の受容体数がより増えることが望ましい。そうであれば、シナプス伝達が増加するためには、あわせてシナプス基部の括約作用が緩むことが、より効率の上昇をもたらすとも考えられる。そこで、ケージドグルタミン酸などを用い、スパイン基部の変化を検討する。また、この変化がミオシンII 依存的かについて検討する。加えて、活性を操作できるCaMKII分子を発現させ、スパイン基部の様子を観察する。
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Research Products
(17 results)
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[Journal Article] Effects of Buyang Huanwu decoction combined with edaravone on mitochondrial apoptotic pathway of nerve cells in mice with cerebral ischemia-reperfusion injury2017
Author(s)
Zhong, F.-F., Wu, C.-L., Zhang, Y.-X., Sun, X.-F., Xie, M.-J., Sato, M
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Journal Title
Int. J. Clin. Exp. Med
Volume: 10(4)
Pages: 6749-6755
Peer Reviewed / Int'l Joint Research
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