2018 Fiscal Year Annual Research Report
Analysis of dynamic structural rearrangements of functioning ion channels by fluorescent unnatural amino acid
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17H04021
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| Research Institution | National Institute for Physiological Sciences |
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Principal Investigator |
久保 義弘 生理学研究所, 分子細胞生理研究領域, 教授 (80211887)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | ATP受容体チャネル / 蛍光非天然アミノ酸 / 動的構造変化 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ATP受容体チャネルP2X2は、典型的な膜電位センサーを分子内に有しないにも関わらず、ATPと膜電位に依存するゲーティングを示す。P2X2の膜電位依存的動的構造変化の解明を目的として、蛍光非天然アミノ酸 (fUAA) を用いた Voltage clamp fluorometry (VCF) 法による解析を進めた。膜貫通部位等の多くの位置に fUAAを網羅的に導入したところ、第2膜貫通部位のAla337およびIle341の位置でのみ膜電位依存的な蛍光強度の変化が観察された。その蛍光強度の変化は、膜電位変化後、緩徐な電流増加とは異なり直ちに起こること、また、記録した膜電位全域でリニアであることから、タンパク質の構造変化を直接レポートするものではないと考えられた。最も妥当な解釈としては、この位置に強い電場がかかっていて、導入したfUAAの有する electrochromic な性質による蛍光強度の変化を見ていると考えられた。構造解析の結果から、ATP存在下では、第一膜貫通部位の Phe44がAla337の近傍に位置する。そこで、Phe44Glu & Ala337Arg の二重変異によりここに静電的ブリッジを形成したところ、開状態に留まることが観察された。以上の結果から、Ala337とPhe44の相互作用が開状態の安定化に重要であること、その相互作用の場が強い電場にさらされているために結合が膜電位の影響を受けることが示唆された。
Two Pore Na+チャネル TPC3についても、第1リピートへの Phosphoinositides の結合による第2リピートの膜電位センサーの動きの変化に焦点をあてて解析を進めた。
GIRKチャネルの機能調節については、抗ヒスタミン薬が機能を阻害することを見出し、その阻害メカニズムと構造基盤の解明を目指して、網羅的に点変異体を作成して機能解析を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
主課題のひとつであるP2X2受容体の膜電位依存的ゲーティングについては、膜貫通部位内の強く電場がかかっていると考えられる箇所の特定に成功し、また活性化の安定下に寄与するその位置での重要な相互作用を見出した。TPC3チャネルおよびGIRKチャネルに関しても、着実に新知見を得ることができた。以上より、順調に進展していると考える。
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| Strategy for Future Research Activity |
P2X2チャネルについては、Ala337およびPhe44を、多種類のアミノ酸に置き換えての網羅的機能解析を行う。さらに、S/N比の向上を目的として、引き続き、Small molecule kinase inhibitorを使用する実験、近傍へのTrp残基導入によるクエンチングを利用する実験を継続する。TPC3チャネルについては、Phosphoinositidesと膜電位の相乗的ゲート機構に関する解析を進め、GIRKチャネルについては、抗ヒスタミン薬の結合の機能阻害のメカニズムにつき、特にチャネルポアの構造変化、PIP2結合との競合等に焦点をあてて解析を継続する。
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Research Products
(10 results)
