2017 Fiscal Year Annual Research Report
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17H04023
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| Research Institution | University of Tsukuba |
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Principal Investigator |
船戸 弘正 筑波大学, 国際統合睡眠医科学研究機構, 教授(WPI-IIIS) (90363118)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
三好 千香 筑波大学, 国際統合睡眠医科学研究機構, 助教 (60613437)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 睡眠覚醒 / 遺伝子改変マウス / リン酸化酵素 / ゲノム編集 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
睡眠覚醒制御の分子機構を明らかにするために、研究代表者らは、ランダム点突然変異マウスを用いたフォワード・ジ ェネティックス研究を遂行し、睡眠異常を示すSleepy変異家系を樹立した。この家系に顕著な睡眠増大をもたらす原因遺伝子変異をリン酸化酵素SIK3に見出した。系統学的によく保存されたPKAリン酸化サイトの欠失が睡眠の増大の原因となる。SIK3はAMPKファミリーに属し、SIK3はSIK1とSIK2とともにSIKサブファミリー形成する。SIK1,2,3の相同性は必ずしも高くないが、キナーゼドメインの相同性は高く、PKAリン酸化サイトも保存されている。このことから、SIK1およびSIK2のPKAリン酸化サイトが、睡眠覚醒制御に重要な役割を果たしている可能性がある。
この可能性を検討するため、本年度はCRISPR法を用いてSIK1およびSIK2のPKAリン酸化部位改変マウスの作製を行った。具体的には、SIK1のセリン577残基およびSIK2のセリン587残基をアラニンに置換した、SIK1 (S577A) マウスおよびSIK2(S587A) マウスを作製した。CRISPRによるゲノム編集には、エレクトロポレーション法を用いてガイドRNAとCas9を導入した。SIK1およびSIK2遺伝子改変マウスはすでに得られており、少なくともヘテロ接合の状態ではlethalではないことを確認した。次世代も得られており、目的遺伝子変異が正しく遺伝することも確認した。またSIK1 (S577A)とSIK2(S587A)ホモ変異マウスを得るためにヘテロマウス同士の交配も行っている。並行して、SIK1 S577とSIK2 S587のリン酸化特異的抗体も作製した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
計画通りに遺伝子改変マウスが作製できた。遺伝性も確認できており睡眠覚醒等の行動実験に取り組む準備が整った。
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| Strategy for Future Research Activity |
計画通りに睡眠覚醒行動の評価を遂行していく。脳波筋電電極を装着する手術を行い、測定した脳波筋電に基づき、覚醒時間、ノンレム睡眠時間、レム睡眠時間を評価する。また、睡眠制御の恒常性を評価するため明期開始時から6時間の睡眠遮断を行い、その後の回復睡眠を評価する。脳波のスペクトラム解析も行い、デルタ波やシータ波の変化も検討する。
SIK3遺伝子変異はヘテロ接合体で顕著な睡眠過多を示すが、ホモ接合体はさらに表現型が強まる。そのため、SIK1およびSI K2についてもSIK1(S577A)およびSIK2(S587A)ヘテロ変異マウス同士を交配させて、SIK1(S577A/ S577A)やSIK2(S587A/S587A)の ホモ変異マウスを得て睡眠覚醒行動を検討する。SIK1は視交叉上核や肝臓に、SIK2は褐色脂肪細胞にも強く発現しているため、恒暗条件での概日リズム行動やエネルギー代謝、糖代謝に関する検討も遂行する。
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Research Products
(10 results)
