革新的質量分析法を用いた悪性中皮腫診断マーカーの同定

2017 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 17H04059
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 鶴山 竜昭 京都大学, 医学研究科, 特定教授 (00303842)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 吉澤 明彦 京都大学, 医学研究科, 准教授 (80378645) ; 平塚 拓也 京都大学, 医学研究科, 特定講師 (90641639)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: 質量分析 / タンパク質 / 中皮腫 / FFPE

Outline of Annual Research Achievements

本研究では、平成29年度研究計画に従い、病理所見データベースの作成と、中皮腫のFFPE標本からタンパク質を作業上効率よく抽出、かつ抽出収率を向上させるためのプロトコールの開発する計画であった。今年度は後者においては基礎技術の確立に努めた。病理所見データベースにおいては中皮腫の亜分類についても詳細に検討をすすめている。
FFPE標本からタンパク質を効率よく溶出するためのプロトコールの開発においては、すでに論文報告している有機溶剤の内容物に添加物を加えて改良に努めただけではなく、FFPE標本の処理においては用手的処理、機材を用いた処理の比較を行い、より均一な破砕を試みた。その結果、均質な破砕が抽出効率の改善に貢献するだけでなく、再現性にも関わることが判明したため、さらに機材を用いて超音波、ビーズ微粒子による破砕法のプロトコールの作成を試みた。いずれの方法においても大幅な収率の向上はまだ実現していないが、ビーズによる破砕法においては検体を多く処理でき、かつ再現性の高い均一なタンパク質溶液を得ることができ、実験操作に要する時間を大幅に軽減できた。次に溶出液の開発を行った。溶出バッファーはアセトニトリル、クエン酸バッファー、Tris-Hcl、Urea、グアニジン塩酸など従来用いられている溶媒の組成を換えるなど検討した。Urea、グアニジン塩酸を含む組成では、それぞれ2倍から4倍の収量の増加が得られた。今後さらに改善をめざす。
また質量分析イメージングについては、新しい画像解析プログラム手法の開発にめどがついた。region of interest(ROI)法の確立、画像データの行列を用いた統括データの作成、統計手法の確立を行い、従来の検定法に加え膨大な画像データ数に依存しない手法を確立した。以上より、予定のほぼ8割から9割程度が達成された。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

今年度は病理所見データベースの作成とFFPEからのタンパク質を効果的に溶出するためのプロトコールの開発する計画であった。病理所見データベースについては、現在、病理検査室、ほか共同で検討する施設の選定や研究体制を構築し、ほぼ当初の計画どおり推移している。
一方、FFPE標本から作業時間の短縮による効率業の効率化、タンパク質の溶出収率の向上については、前者は、FFPEの処理機材の選定が終了し、これにより作業の効率化が大幅の向上し、操作にかかる時間を軽減できるだけでなく再現性が得られることが明らかになった。このために、作業工程への装置新規導入や破砕時間、破砕回数の最適化がなど具体的な作業のフロー工程の確立がほぼ終わった。一方、後者においては、当初めざしたタンパク質溶出効率の大幅な向上は達成されていないため、なお現在大きな課題としてまだ残っている。さまざまな方法で再現性は確保されるようになったが、収量の面で、これまで私たちが報告した方法を越えるものはまだできておらず、検討の余地が大きい。中皮腫における肺組織は、線維性結合組織が多いため、この課題を克服する必要がある。一方、質量分析イメージングについては、新しい画像解析プログラム手法のめどがつき、タンパク質の二次元分布の比較の定量化が可能となり、画像分析法の再現性の向上については、予想された以上の成果が得られたことは大きい。

Strategy for Future Research Activity

中皮腫の症例を亜分類ごとに20例ずつ選定をすすめ、病理組織診断および臨床情報を含む統合データベースの作成をすすめ完成させる。
一方、前年度に目標の達成ができていないタンパク質溶出の向上を可能にするプロトコールのさらなる改善と開発をさらにすすめる。具体的には現在の溶出効率の5倍をめどに溶出溶液の改善、最適化をすすめる。その段階で、後半からは溶出タンパク質を用いて実際に液相クロマトグラフィー質量分析を実際に行い、分析プロトコールの最適化をすすめる。中皮腫における亜分類ごとのバイオマーカーの探索を行う。特に亜分類ごとの相互比較により、組織型特異的なタンパク質の同定を実施する。これと並行し、質量分析イメージングを行い、バイオマーカー候補となる特異的なタンパク質の発現とその組織上の二次元分布領域を調べる。この方法においても亜分類ごとの相互比較を実施することにより、組織型特異的なタンパク質の同定を実施する。画像分析手法については、ROI法に加えて、クラスタ分析法も今後積極的に導入をすすめ、中皮腫の亜分類ごとの照合検討をすすめたい。特に臨床情報との照合により予後に関する新規バイオマーカーを探索する。以上の質量分析データの妥当性を検証するため、免疫染色などの手法により別途検証を行う。