2017 Fiscal Year Annual Research Report
薬剤耐性マラリアの出現を予測する：加速進化系による包括的実験室進化システムの開発
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17H04074
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| Research Institution | Juntendo University |
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Principal Investigator |
美田 敏宏 順天堂大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (80318013)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
平井 誠 順天堂大学, 医学部, 准教授 (50326849)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | マラリア / 薬剤耐性 / ミューテータ / 実験室進化 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
現在の熱帯熱マラリア薬剤耐性研究は、すでに出現・拡散した薬剤耐性原虫を用いることが出発点となっているため、耐性遺伝子を同定しても実際面でのインパクトは弱い。本研究では、通常の50～100倍多く遺伝子変異を起こすミューテータ熱帯熱マラリア原虫による包括的実験室進化システムを開発し、その壁を乗り越える。ミューテータは、DNA複製酵素の校正活性のみを低下させ、本来修復されるエラーをそのままゲノム内に取り込ませることで変異率の上昇を狙ったシステムである。
H29年度は通常より約100倍変異が蓄積する熱帯熱マラリア原虫ミューテータの作製を目標とした。
1）熱帯熱マラリア原虫のDNA合成酵素の校正活性に必須なDNAポリメラーゼδのアミノ酸2ヶ所（D308, E311）は、他の生物の場合と同様に完全に保存されており、申請者らによる先行研究においてネズミマラリア原虫の当該遺伝子の2ヶ所に該当するコドンをアラニンに置換することでミューテータ化に成功しており、熱帯熱マラリア原虫においても同様の方法を試みた。プラスミドを作成後に遺伝子導入を試みたが、安定した形質の発現に至らなかった。
2）DNAポリメラーゼεのノックダウンも酵母の系でミューテータ形質を賦与することが報告されており、組み換え原虫の作成が容易なマウスマラリアで試みた。その結果、安定した形質を持ったミューテータマウスマラリア原虫の作成に成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
薬剤耐性原虫の単離実験を予定の8月に開始できなかった。これは、ゲノム編集によって安定した形質を持つDNAポリメラーゼδ組み換え原虫の作成に難渋したためである。その原因として、Cas9自体が目的とするノックダウン原虫の発育を阻害している可能性を発見した。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後の研究の推進方策については変更はない。
当初予定からやや遅れているDNAポリメラーゼδ組み換え原虫の作成については、新しいプラスミドの作成が終了した。すでに新たな遺伝子導入法による実験を実施しており、次年度中に達成が可能である。
ミューテータ原虫の単離に成功したら、アルテミシニン併用療法のパートナー薬として用いられているルメファントリン、ピペラキン、アモディアキン、メフロキンの薬剤圧下で培養し、それぞれの抗マラリア薬に対する耐性原虫を単離する。つぎに、上記併用剤へ耐性化したミューテータ原虫を、さらにARTへ耐性化させていき、いまだ野生では出現してないアルテミシニン併用療法への完全耐性原虫を単離する。
さらに、実集団での薬剤耐性原虫のゲノム解析をすすめ、実験室進化の結果を検証する。われわれはウガンダの調査でアフリカで初めてのアルテミシニン耐性原虫を同定した（Emerg Infect Dis, 2018）。本年度も引き続き調査を実施し、実集団においてどのようなゲノムの変化が起こっているのかを検討する。本結果とミューテータ原虫から得られたアルテミシニン耐性原虫ゲノムの比較により、すでに推定耐性変異は実際のフィールドで出現しはじめているのか、その変異は自然集団ではどれぐらいおこりやすいのかについて検証する。
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Research Products
(21 results)
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[Journal Article] Absence of in vivo selection for K13 mutations after artemether-lumefantrine treatment in Uganda.2017
Author(s)
Balikagala B, Mita T, Ikeda M, Sakurai M, Yatsushiro S, Takahashi N, Tachibana SI, Auma M, Ntege EH, Ito D, Takashima E, Palacpac NM, Egwang TG, Onen JO, Kataoka M, Kimura E, Horii T, Tsuboi T.
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Journal Title
Malar J.
Volume: 16
Pages: 23
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
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[Presentation] ウガンダにおけるin vivo薬剤耐性試験およびRSAを用いたアルテミシニン耐性疫学調査.2017
Author(s)
池田美恵, 橘真一郎, 山内祐人, Auma M, 関原誠, 森稔幸, 平井誠, Palacpac N, 木村英作, Aginya E, 堀井俊宏, 美田敏宏.
Organizer
第86回日本寄生虫学会大会
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[Presentation] ウガンダ国の熱帯熱マラリア患者において腸内細菌叢の変化が起こる.2017
Author(s)
谷口委代, 宮内栄治, OliaAlex, 長安英治, OsbertKaturo, 鈴江一友, 今井孝, 下川周子, 大西里咲, I. O-A, PalacpacNirianne, 丸山治彦, 木村英作, 美田敏宏, 大野博司, 堀井俊宏, 久枝一.
Organizer
グローバルヘルス合同大会プログラム・抄録集.
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[Presentation] ウガンダにおける熱帯熱マラリア原虫キニーネ感受性の実態.2017
Author(s)
山内祐人, 橘真一郎, 池田美恵, 関原誠, Balikagala B, 八代-櫻井美樹, 平井誠, Palacpac N, 木村英作, 堀井俊宏, 美田敏宏.
Organizer
第86回日本寄生虫学会大会
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[Presentation] 宿主内競争による熱帯熱マラリア原虫のクロロキン感受性の回復.2017
Author(s)
橘真一郎, 池田美恵, Balikagala B, 櫻井美樹, 八代聖基, 関原誠, 山内祐人, Auma MA, 平井誠, 森稔幸, Palacpac N, 片岡正俊, 木村英作, 堀井俊宏, 美田敏宏.
Organizer
第86回日本寄生虫学会大会
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[Presentation] Detection of artemisinin-resistant Plasmodium falciparum isolates with ex-vivo ring-stage survival assay in Uganda.2017
Author(s)
Mita T, Ikeda M, Kaneko M, Balikagala B, Tachibana S-I, Sakurai-Yatsushiro M, Yatsushiro S, Takahashi N, Hashimoto M, Katuro O, Olia A, Obwoya P, Auma M, Anywar D, Odongo-Aginya E, Hirai M, Palacpac N, Kataoka M, Tsuboi T, Kimura E, Horii T.
Organizer
Keystone Symposia Conference: Malaria:
Int'l Joint Research
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[Presentation] Application of a cell microarray chip system for accurate, highly sensitive, and rapid diagnosis for malaria.2017
Author(s)
Kataoka M, Yatsushiro S, Yamamoto T, Oka H, Okello-Onen J, Odongo-Aginya E, Palacpac N, Mita T, Baba Y, Horii T.
Organizer
Keystone Symposia Conference: Malaria
Int'l Joint Research
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