2017 Fiscal Year Annual Research Report
Developments of functional single-chain antibodies and unraveling of mechanisms of diseases associated with advanced glycation end-products
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17H04105
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| Research Institution | Kumamoto University |
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Principal Investigator |
森岡 弘志 熊本大学, 大学院生命科学研究部(薬), 教授 (20230097)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
竹内 正義 金沢医科大学, 総合医学研究所, 教授 (20154982)
小橋川 敬博 熊本大学, 大学院生命科学研究部(薬), 准教授 (90455600)
佐藤 卓史 熊本大学, 大学院生命科学研究部(薬), 助教 (70555755)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 一本鎖抗体 / 終末糖化産物 / プロテオーム解析 / バイオマーカー / 糖尿病性腎症 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
生体内のタンパク質が糖化されてできる終末糖化産物（AGEs）は、加齢や高血糖状態の持続により蓄積され、AGEs受容体の一種であるRAGE（Receptor for AGEs）に結合し、糖尿病合併症などの生活習慣病に強く関与すると考えられている。本研究では、AGEs構造を特異的に識別する一本鎖抗体（scFv）にβグルカン認識タンパク質（βGRP）を結合させた機能性一本鎖抗体（scFv-GRP融合抗体）を調製し、それらを用いて血液中に存在するAGEs修飾されたタンパク質の選択的な分離・濃縮を行った。さらに、質量分析法によるプロテオーム解析によって、濃縮された糖化タンパク質の同定を行い、AGEs関連疾患の診断・予防に有用なバイオマーカーの探索を進めている。
大腸菌を用いた遺伝子発現システムで、AGEs抗原としてGA-pyridineおよびCMLに特異的な73MuL9scFv-GRPおよびCMLscFv-GRPを調製した。これらの融合抗体とカードランビーズを用いたアフィニティーシステム（免疫沈降法）を構築し、非特異的吸着が極めて少ない工程で、健常人の血清試料中から様々なGA-pyridine修飾タンパク質およびCML修飾タンパク質を濃縮することに成功した。
それらの濃縮液をWestern blottingによって解析した結果、GA-pyridineおよびCML修飾タンパク質が特異的に濃縮されていることが確認できた。特に、GA-pyridine特異的な73MuL9scFv-GRP融合抗体を用いた実験から、LC-MS/MS測定後、UniProt human proteome databaseにより107種類のタンパク質が同定された。
現在、標的タンパク質の選択ならびに免疫沈降の改善方法の検討を行っており、LC-MS/MS解析により糖化修飾部位の決定のための研究を進めている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
GA-pyridineおよびCMLに特異的なscFv-GRP融合抗体それぞれの調製方法を改良し、研究遂行に必要な十分量の機能性融合抗体を精製することが可能となった。健常人の血清および血漿試料を用いて、GA-pyridineならびにCML修飾された血清タンパク質の分離・濃縮を行ったところ、生体内物質の非特異的吸着が極めて少ない優れた方法であることが示された。現在、質量分析法によるプロテオーム解析を続けており、標的タンパク質の選択、ならびに、糖化タンパク質の糖化部位の同定を進めている。
一方、TAGEの化学構造の決定に関しては、現時点では未だ明らかにされていない。ペプチド合成用試薬であるベンジルオキシカルボニルリジン（Z-Lys）を原料にして、グリセルアルデヒド（GCA）を反応させ、TAGEを含むAGEs混合物を得た後、逆相HPLC による分離・分画、TAGE特異的抗体を用いた競合ELISAによる抗体結合活性を指標とした生成物の分離を進めている。AGEs混合物の中に抗体結合活性が認められているが、単一ピークとしての分画には至っておらず、今後はHPLCの分離条件等の検討が必要となっている。
また、TAGE特異的抗体のVH領域およびVL領域のアミノ酸配列を決定し、遺伝子操作によりscFv抗体の調製を行った。現在、TAGEscFv-GRP融合抗体遺伝子の作製を進めている。
さらに、AGEs-RAGE病因説を立証するため、遺伝子組み換え型RAGEのリガンド結合ドメインの調製を行い、現在、GA-pyridine修飾されたアミノ酸との分子間相互作用を物理化学的手法（DSF）により解析している。
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| Strategy for Future Research Activity |
健常人の血液試料を用いた実験で、GA-pyridineおよびCML糖化修飾タンパク質の分離・濃縮方法を確立することができたので、今後は糖尿病合併症（腎症）の臨床検体から、同様に糖化修飾タンパク質の分離・濃縮を行う。質量分析法によるプロテオーム解析を進め、特定された糖化タンパク質の種類と検体の臨床検査データとの相関を精査しながら、AGEs関連疾患の診断・予防に有用なバイオマーカーの探索を行う。
一方、TAGEに関しては、その化学構造の解析を引き続き行う。また、TAGE特異的なscFv抗体に関しては、ファージディスプレイ法により高品質なTAGE特異的scFv抗体の獲得を進める。さらに、TAGE特異的な機能性一本鎖抗体（TAGEscFv-GRP融合抗体）を調製し、上記同様の臨床検体を用いて、TAGE修飾された血清タンパク質の分離・濃縮、質量分析法によるプロテオーム解析を行い、バイオマーカーの探索を行う。
また、AGEs-RAGE病因説を立証するため、GA-pyridineならびにTAGE修飾されたアミノ酸を用いて、細胞応答、細胞障害、酸化ストレス作用などを生化学・細胞生物学的に解析すると同時に、遺伝子組み換え型RAGEのリガンド結合ドメインとの分子間相互作用の詳細を物理化学的手法（DSF、ITC、NMR等）により解析する。得られたデータを総合的に解析・評価することで、糖尿病関連疾患の発症・進展の分子メカニズムを明らかにする。
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[Journal Article] Production of Single-Chain Fv Antibodies Specific for GA-Pyridine, an Advanced Glycation End-Product (AGE), with Reduced Inter-Domain Motion2017
Author(s)
Fukuda N, Noi K, Weng LD, Kobashigawa Y, Miyazaki H, Wakeyama Y, Takaki M, Nakahara Y, Tatsuno Y, Uchida-Kamekura M, Suwa Y, Sato T, Ichikawa-Tomikawa N, Nomizu M, Fujiwara Y, Ohsaka F, Saitoh T, Maenaka K, Kumeta H, Shinya S, Kojima C, Ogura T, Morioka H
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Journal Title
Molecules
Volume: 22
Pages: 1695
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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