2017 Fiscal Year Annual Research Report

Identification of sperm small RNAs involved in multigenerational health effects of environmental chemicals

Research Project

Project/Area Number	17H04139
Research Institution	National Institute for Environmental Studies
Principal Investigator	野原恵子国立研究開発法人国立環境研究所, 環境リスク・健康研究センター, フェロー (50160271)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	秦健一郎国立研究開発法人国立成育医療研究センター, 周産期病態研究部, 部長 (60360335)
Project Period (FY)	2017-04-01 – 2020-03-31
Keywords	次世代影響 / 無機ヒ素 / 精子 / small RNA / 妊娠期曝露
Outline of Annual Research Achievements	１）妊娠期無機ヒ素曝露群（ヒ素群）F1の作製・繁殖と精子RNAの調製：　C3Hマウス (F0) の妊娠8日から18日に通常の水または亜ヒ酸ナトリウム (85 ppm) を含む水を自由摂取させ、仔（対照群またはヒ素群F1）を得た。対照群およびヒ素群F1雄の精巣上体尾部から精子を取り出し、体細胞リシスを行って体細胞の混入のない精子を得、RNAを調製した。２）F1精子miRNAのマイクロアレイ解析：対照群およびヒ素群F1から調製した精子RNAについて、miRNA用マイクロアレイ (Affymetrix)を用いて解析を行い、対照群と比較してヒ素群で存在量が変化したmiRNAを明らかにした。さらにPubMed検索でCancerとの関連等が報告されているmiRNAを選抜し、発現量の変化をreal-time PCRで検証した。その結果、サンプル間のばらつきが大きいサンプルが多く見られたことから、有意差のある変化を検出するためには今後さらにサンプル数を増やして検討する必要性が考えられた。３）マウス受精卵のRNA調製法の検討：体外受精によってマウス受精卵を作製し、RNA調製を行って収量を検討した。４）small RNA次世代シークエンス (small RNA-seq)データ解析用パイプラインの構築：既知miRNA定量解析、新規miRNA探索、miRNA以外のsmall RNAの分類を可能とする包括的small RNA解析ソフトウェアパッケージおよびtRFの解析に特化したデータベース・ウェブツールを導入し、small RNA-seqデータ解析用パイプラインを構築し、評価した。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 対照群とヒ素群マウスF1の精子miRNAのマイクロアレイ解析を行い、発現量が変化したものについてreal-time PCRを行ったところ、同一の群の中でも発現量にばらつきが大きいmiRNAが多く認められた。それらがmiRNA発現のもともとの特徴であるのか検討するために、次年度に再度サンプル数を増やして実験を行うよう計画を変更した。
Strategy for Future Research Activity	１）F1精子の再調製とmiRNA解析：対照群と妊娠期ヒ素曝露群（ヒ素群）のF1より精子を調製し全RNA画分を精製する。マイクロアレイ法でmiRNAの網羅的解析を行い、ヒ素群で存在量が変化するmiRNAを明らかにする。マイクロアレイ法で得られた結果をReal-time PCRで検証する。またヒ素群F1の精子で変動したmiRNA のターゲットとなる遺伝子発現をmiRanda, TragetScan等のアプリケーションを用いて抽出し、影響を及ぼしうる経路を予測する。２）F1精子small RNA-seq用RNAの調製、ライブラリーの作製とsmall RNA-seq：対照群およびヒ素群F1精子全RNAよりsmall RNAの5’および3’末端へのアダプター付加、逆転写、増幅によってsmall RNA-seq用ライブラリーを調製する。次世代シークエンスを行い、初年度に構築したデータ解析パイプラインでmiRNA, tRF, piRNA等のsmall RNAの定量的解析を実施する。