Multiomics analysis of auto reactive immune cells in the inflammatory sites in autoimmune diseases.

2017 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 17H04216
• Research Institution: Keio University
• Principal Investigator: 竹内 勤 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 教授 (50179610)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 鈴木 勝也 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 講師 (70306695) ; 竹下 勝 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 助教 (10571135)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: B細胞 / シェーグレン症候群 / 自己抗体

Outline of Annual Research Achievements

①病変局所からの抗体産生B細胞の分取、シングルセルcDNAライブラリの作成：シェーグレン症候群患者およびシェーグレン症候群の診断基準を満たさないドライマウスの患者の小唾液腺生検検体を十数例入手した。入手後すぐに細切しコラゲナーゼ処理を行い、単細胞まで分離し、抗体産生B細胞をセルソーターによりシングルセルとして96ウェルプレートに分取するまでのプロトコルを確立した。さらに、Smart-seq2法でシングルセルcDNAライブラリを作成するまでの最適な試薬・PCR条件を確立した。
②B細胞受容体の遺伝子配列の解析：上記cDNAライブラリからPCR 法でB 細胞受容体のH鎖・L鎖の遺伝子配列を解析するためのプライマー設計やベクター設計、PCRなどの条件設定を行ない、効率的にH鎖・L鎖をクローニングできる手法を確立した。さらに、それぞれの遺伝子を発現ベクターに組み込み、300種類以上のプラスミドを作成した。それらを用いて哺乳類細胞系でリコンビナント蛋白質(モノクローナル抗体)として発現させ、精製する手法を確立した。その結果として、数人のシェーグレン症候群患者およびシェーグレン症候群の診断基準を満たさないドライマウスの患者から、100種類程度の抗体ライブラリを作成することができた。
③抗体特異性の解析：上記で作成した抗体を、自己抗体測定用のELISAを用いてプレ検討したところ、複数個の自己抗体が含まれていることを確認した。今後は十分な抗体数をそろえて再度同様の検討を行う予定とした。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

実際に病変局所のB細胞の抗体ライブラリを作成することができた。かつ、その中に自己抗体が含まれていた。

Strategy for Future Research Activity

抗体の数を増やし、自己反応性を検討する。自己以外に対する反応も検討することを考慮する。ある程度B細胞の結果がまとまり次第、T細胞も行う。