2017 Fiscal Year Annual Research Report
The Study of Pathophysiological Role of GFRA2, GPI-anchored plasma Membrane Protein, for Left Ventricular Non-Compaction Cardiomyopathy
| Project/Area Number |
17H04228
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
八代 健太 大阪大学, 医学系研究科, 特任准教授(常勤) (60432506)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 心筋緻密化障害 / GFRA1/2新規シグナル経路 / 心臓発生 / 心筋分化 / 臨床遺伝学 / ゲノム編集 / ヒトゲノム研究 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、マウス胚に心筋緻密化障害心筋症を引き起こすGFRA1/2 を介した新規シグナル経路の本態を明らかにし、難治性かつ予後不良なヒト心筋緻密化障害に関し多くが不明なままの病理病態と臨床遺伝学的背景の理解を深める基盤研究を行う。計画している研究項目は、(1) 心臓発生に必要な新規 GFRA1/2 シグナル経路の解明、(2) Gfra1/2のマウス心臓発生における心筋緻密化過程に果たす役割の詳細な解析、および (3) ヒト心筋 緻密化障害患者の GFRA1/2 遺伝子変異探索によるヒトの病態での生理的意義の確認である。
（１）心臓発生に必要な新規 GFRA1/2 シグナル経路の解明に関し、マウスES 細胞にてGFRA2と相互作用をする分子を探索するため、まずはCRISPR/Cas9によるゲノム編集技術を用いてGFRA2タンパクにタグを標識するゲノム編集を行う計画である。ゲノム編集作業を行うための準備（targeting vectorの構築と、CRISPR/Cas9の準備）に着手し、これを完了した。
（２）Gfra1/2のマウス心臓発生における心筋緻密化過程に果たす役割の詳細な解析を行うために、まずはGfra2を発現した細胞系譜をマウス胚体内で追跡するためのマウスと、コンディショナル・ノックアウト・マウスを作成する研究計画である。この作業に必要なttargeting vectorの構築とCRISPR/Cas9の準備を完了し、マウス作成作業へ着手した。
（３）ヒト心筋 緻密化障害患者の GFRA1/2 遺伝子変異探索によるヒトの病態での生理的意義の確認においては、研究を推進するための研究ネットワークの構築を完了した。現在は学内でのヒトゲノム研究の承認審査に対して準備中である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
３つの目標項目に関連した研究計画に 従い研究を開始し、現在は以下の状況にある。
（１）心臓発生に必要な新規 GFRA1/2 シグナル経路の解明； GFRA2と相互作用をする分子を探索するために必要なマウスES細胞のゲノム編集に用いるtargeting vectorの構築を終了し、現在はゲノム編集作業を進行中である。英国から研究環境を日本へ移したため、英国で使用していた同じ試薬・材料が手に入らない等の理由から、マウスES細胞の培養方法の最適化に時間を要した。また、当初は、targeting vectorをlong single oligo nucleotideとして用いる計画であったが、マウスES細胞では実験系が作動しなかった。現在はHomology-Independent Targeted Integration（HITI）法へと変更し実施している。
（２）Gfra1/2のマウス心臓発生における心筋緻密化過程に果たす役割の詳細な解析；計画通りにtargeting vectorの構築は終了し、現在はCRISPR/Cas9を用いた遺伝子改変マウスの作成作業中である。
（３）ヒト心筋 緻密化障害患者の GFRA1/2 遺伝子変異探索によるヒトの病態での生理的意義の確認；検体採取のためのネットワークの構築を完了し、ヒトゲノム研究を行うための認可申請準備を行なっている。ゲノム検体採取のためのボランティア患者のリクルートには未だ着手できていない。
上述の如く、英国から日本へと研究環境を移したことで不測の事態に直面したこと、認可手続きに時間を要していること、また研究に参画する人員の絶対的な不足により、やや進捗状況に当初の研究計画から遅れを生じている。
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| Strategy for Future Research Activity |
（１）心臓発生に必要な新規 GFRA1/2 シグナル経路の解明； マウスES細胞での遺伝子改変作業を終了し、遺伝子発現解析とタンパク発現解析に着手する。
（２）Gfra1/2のマウス心臓発生における心筋緻密化過程に果たす役割の詳細な解析；遺伝子改変動物の作成を本年度中に終了し、変異マウスの表現型の解析に着手する。
（３）ヒト心筋 緻密化障害患者の GFRA1/2 遺伝子変異探索によるヒトの病態での生理的意義の確認；年度内に学内でのヒトゲノム研究の承認を得、附属病院小児科外来における検体採取作業へと着手出来るようにしたい。
研究進捗の遅れの原因には、絶対的な人員不足も大きな要因として挙げられる。これを解消するために、大学院生のリクルートを積極的に行いたい。
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Research Products
(8 results)
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[Presentation] Glycosylphosphatidylinositol-anchor containing neurotrophic factor receptor GFRA2 identifies cardiac progenitors and mediates cardiomyocyte differentiation via an alternative signal pathway.2017
Author(s)
Hidekazu Ishida, Rie Saba, Ioannis Kokkinopoulos, Yasushi Sakata, Leo Dunkel, Andrew Tinker, Anna-Katerina Hadjantonakis, Yoshiki Sawa, Hiroshi Sasaki, Keiichi Ozono, Ken Suzuki, and Kenta Yashiro
Organizer
Takao International Symposium 2017
Int'l Joint Research
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[Presentation] Glycosylphosphatidylinositol-anchor containing neurotrophic factor receptor GFRA2 identifies cardiac progenitors and mediates cardiomyocyte differentiation via an alternative signal pathway.2017
Author(s)
Hidekazu Ishida, Rie Saba, Ioannis Kokkinopoulos, Yasushi Sakata, Leo Dunkel, Andrew Tinker, Anna-Katerina Hadjantonakis, Yoshiki Sawa, Hiroshi Sasaki, Keiichi Ozono, Ken Suzuki, and Kenta Yashiro
Organizer
Weinstein Cardiovascular Development and Regeneration Conference 2017
Int'l Joint Research
