2018 Fiscal Year Annual Research Report
Generation of bullous pemphigoid antigen specific T cell clones
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17H04238
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
氏家 英之 北海道大学, 大学病院, 講師 (60374435)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
岩田 浩明 北海道大学, 大学病院, 助教 (20397334)
西江 渉 北海道大学, 医学研究院, 准教授 (20443955)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | T細胞株 / 水疱性類天疱瘡 / 17型コラーゲン / BP180 / アクティブマウスモデル |
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| Outline of Annual Research Achievements |
C57BL/6マウスにマウスCOL17を免疫しても、低力価の抗マウスCOL17抗体しか得られないことが多い。そこで、本研究では、ヒトCOL17反応性T細胞株を樹立を試みている。ヒトCOL17NC16A領域の病原性エピトープをカバーする合成ペプチド（R7）を用いてC57BL/6マウスのFoot padsに免疫し、膝窩リンパ節と脾細胞を採取して培養し、R7ペプチドで刺激を加えながら細胞株の樹立を試みたが良好な結果は得られなかった。そこで、R7ペプチドのサイズが小さいため免疫原性が低かった可能性を考え、免疫原をNC16A領域全体をカバーするNC16A全長タンパクに変更した。免疫したマウスからリンパ節を採取し、R7ペプチドで刺激したfeeder細胞とT-STIMを加えて培養したところ、細胞のクラスターが出現した。サイミジン取り込みが確認できたウェルの細胞を限界希釈し、更にR7ペプチドで刺激したところ、Day35～42頃から細胞クラスターが出現し、その後も良好な増殖示す細胞株が20ライン得られた。これらの細胞株の5つからmRNAを採取しcDNAに変換したのちPCR法でT細胞受容体（TCR）遺伝子を増幅させたところ、数個のバンドが見られたため、得られた細胞株はオリゴクローナルであると考えた。また、細胞株の表面マーカーをフローサイトメトリー法で解析したところ、全てCD4+T細胞であり、かつCD44highCD62Llowのeffector phenotypeを呈していた。サイトカイン産生を解析したところ、60-70%の細胞がIFN-gを産生していたが、IL-4やIL-17Aを産生する細胞はみられなかった。これらのT細胞株を精製し野生型のB細胞と共にRag-2KO/COL17ヒト化マウスに野生型マウスに共移入したが、T細胞の生着はみられなかった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
平成30年度の目標であったCD4+T細胞株からのTCR遺伝子のクローニングには至らなかったので計画よりはやや遅れていることになる。ヒトCOL17反応性CD4+T細胞株を得てin vivoに移入するところまでは到達したが、良好な生着が得られなかった点が予想外であった。理由としてT細胞株のviabilityが低下している可能性や、R7ペプチド反応性のT細胞株は生体内に移入された時に生体内のヒトCOL17で活性化されない可能性が考えられた。これらの点を改善することでより良い成果が得られると考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
今年度は、最初の免疫に用いる抗原と培養細胞の刺激の際に使用する抗原を変更する。具体的には、ヒトCOL17を皮膚に発現するトランスジェニックマウス皮膚を野生型マウスに植皮し、そのマウスから皮膚所属リンパ節あるいは脾細胞を採取する。または、植皮した野生型マウスの脾細胞をRag-/-/COL17ヒト化マウスに移入してBPを誘導し（アクティブBPマウスモデル）、day7-9のリンパ球を回収する。これらの方法で、in vivoでヒトCOL17に反応するリンパ球が得られる可能性が上昇すると考えている。培養細胞の刺激の際に使用する抗原タンパクとしてこれまでR7ペプチドを用いてきたが、サイズが小さいため抗原提示される効率が低い可能性がある。そこで新たに哺乳類細胞でNC16A全長タンパクを作製し（大腸菌由来ではエンドトキシンが混入しin vitroで使用するのが困難なため）、培養細胞の刺激に用いる。
これらの方法で良好なクラスターが得られた場合は、それがモノクローナルであるかどうか確認するために、T細胞受容体のタイプをPCR法で確認する。また、そのT細胞株の表面マーカー（CD3, CD4, CD8）やサイトカイン産生プロファイルをフローサイトメトリー法で解析する。樹立したCD4+T細胞株のin vivoでの病原性を評価するために、T細胞株をヒトCOL17タンパクで免疫したマウスのB細胞とともにRagノックアウト/COL17ヒト化マウスに移入する。レシピエントマウスにおける抗体産生や、皮膚の臨床的および病理学的変化、脱毛や白毛化の有無、血中抗ヒトCOL17抗体価や抗体サブクラスを評価し、CD4+T細胞株による病原性の差について検討する。病原性のあるT細胞株が得られた場合にはTCR遺伝子をクローニングし、トランスジェニックマウスの作製に進めていく。
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