Molecule target for treatment and companion diagnostic tool of peritoneal dissemination in gastric cancer

2017 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 17H04281
• Research Institution: Nagoya University
• Principal Investigator: 小寺 泰弘 名古屋大学, 医学系研究科, 教授 (10345879)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 神田 光郎 名古屋大学, 医学部附属病院, 助教 (00644668) ; 林 真路 名古屋大学, 医学部附属病院, 病院助教 (70755503) ; 田中 千恵 名古屋大学, 医学部附属病院, 助教 (50589786) ; 小林 大介 名古屋大学, 医学部附属病院, 病院助教 (30635595)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: 胃癌 / 腹膜播種 / 分子標的治療

Outline of Annual Research Achievements

胃癌は本邦では依然として頻度が高く、切除不能な症例の予後は不良である。胃癌の予後に大きく関わる再発転移形式として腹膜転移、リンパ節転移、血行性転移という全く性質が異なるがどれも重要な3つの転移経路が存在することで知られる。なかでも腹膜播種は、胃癌で特に多く見られ、難治な転移再発形式であり、申請者らはその治療のために先進医療を含む多くの臨床研究を展開してきた。本研究では、各種転移形式ないしは転移経路に特異的な分子生物学的機序の解明を通じ、腹膜転移に特化した分子標的とその治療薬を見出すことを目標としている。また、阻害することで治療効果が期待できる治療標的分子を開発すると同時に、感受性のある患者の選別に資するコンパニオン診断法が開発できれば意義深い。申請者らはまず治療・診断の両面でキーとなりうる候補分子を探索するために、Stage IIIで同一の術後補助化学療法を受けていながら再発形式の異なる4群の胃癌原発巣組織を対象としたtranscriptome解析を行った。その結果、腹膜播種再発例のみで有意な発現亢進を示した分子としてsynaptotagmin 13 (SYT13) を同定した。SYT13は小胞輸送調節膜貫通型蛋白であり、さまざまな増殖因子を介した腫瘍細胞の増殖や抗癌剤の代謝に関連している可能性があるため、魅力的な候補分子と判断し、次のステップである発現・機能解析に進んでいる。
・in vitro発現・機能解析: SYT13は胃癌細胞株の70％で高発現していた。siRNA法によるノックダウンを行ったところ、胃癌細胞株の浸潤能および遊走能が有意に低下した。
・臨床検体におけるSYT13発現解析: 胃癌原発巣組織中のSYT13 mRNA発現は臨床病期そのものには依存せず、腹膜播種再発もしくは同時性播種と有意に相関していた。組織中SYT13発現は免疫組織化学染色法でも判定しえた。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

まず研究計画に則り、SYT13の胃癌細胞株における機能解析と、臨床検体での発現解析を開始した。まず胃癌細胞株におけるSYT13の発現度を調べ、SYT13に特異的なsiRNA法によるノックダウン実験に使用する細胞株を選定した。SYT13高発現株に対して、ノックダウン前後での細胞株の増殖、遊走、浸潤能、細胞周期分布、5-FU感受性の変化を調べたところ、SYT13ノックダウンによって細胞浸潤能と遊走能において有意な低下が認められた。SYT13がどのようなEMT関連分子に干渉することで胃癌悪性度に関与しているかを調べるためPCR array法による網羅的解析を行ったところSYT13発現と有意な正の相関関係を有する分子が複数、見出された。胃癌手術時に採取した胃癌原発巣組織中のSYT13 mRNA発現は臨床病期そのものには依存せず、治癒切除後に腹膜播種再発を来したStage II/III胃癌症例、および手術時にすでに腹膜播種を有したStage IV症例において有意に上昇していた。組織中SYT13発現度は、免疫組織化学染色法により蛋白レベルでも判定可能であった。

Strategy for Future Research Activity

平成30年度は、計画どおりにSYT13阻害の胃癌腹膜播種治療効果の検証と阻害薬創製を進めていく。予備実験ではSYT13に特異的なsiRNAの腹腔内投与によりマウスの生存期間は延長していたが、siRNA投与期間が限定されていたため、投与群でも投与中止後に病状が進行して死亡した。このことから、投与期間を延長すればさらなる予後延長効果が得られた可能性がある。また、in vitro実験ではSYT13ノックダウン時に遊走能および浸潤能の強い抑制効果を認めており、SYT13阻害で遊離癌細胞を足止めした上での殺細胞性抗腫瘍剤との併用効果に大いに期待ができると考えている。マウス腹膜播種モデルを作成し、コントロール群、siRNA腹腔内投与単独群（週2回）、paclitaxel (PTX) 腹腔内投与単独群（週1回）、siRNA+PTX併用腹腔内投与群の4 群間で、体重、腹囲、in vivo imagingによる腹膜播種形成量、生存期間を比較解析する。
腹腔内投与を見据えた際、腹膜透過性の観点から、腹腔内の癌細胞に長時間作用し、かつ腹膜通過を経た全身移行による有害事象を最小限にするためには分子量の大きい抗体医薬が理想的である。SYT13は細胞膜上に存在する膜タンパクであり、核酸医薬以外のアプローチとしてSYT13特異的中和抗体をまず試みる。解析ソフトを用いて抗原性、親水性を推測しまず抗SYT13ポリクローナル抗体を作製する。