2018 Fiscal Year Annual Research Report
Intraperitoineal exosome as a novel target for peritoneal metastasis
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17H04286
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| Research Institution | Jichi Medical University |
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Principal Investigator |
北山 丈二 自治医科大学, 医学部, 教授 (20251308)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
佐田 尚宏 自治医科大学, 医学部, 教授 (20261977)
山口 博紀 自治医科大学, 医学部, 教授 (20376445)
三木 厚 自治医科大学, 医学部, 講師 (20570378)
細谷 好則 自治医科大学, 医学部, 教授 (30275698)
大澤 英之 自治医科大学, 医学部, 講師 (60458271)
寺谷 工 自治医科大学, 医学部, 講師 (70373404)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 腹膜播種 / エクソソーム / バイオマーカー / マイクロＲＮＡ / ＣＡＲＴ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
消化器癌腹膜播種に対するタキサン腹腔内反復化学療法の治療方針を決定する上で重要な役割を果たすと考えられる新たなバイオマーカーの探索の一貫として、腹腔内に存在するエクソソーム中に存在する機能分子の解析を行うとともに臨床応用できる知見を得る事を目標とする。
（１）継続中の腹腔内液中のCEAmRNA定量値の意義に関する最終結果を得た。
（２）腹膜播種陽性患者および陰性患者の腹水・洗浄液から超遠心法を用いてエクソソーム分画を抽出、電子顕微鏡像とナノ粒子解析装置を用いた粒子分布で確認し、解析に十分な量のタンパク、RNA量が得られることを確認したうえで、播種陽性群のみで発現が亢進しているマイクロRNA12種類および播種陰性群で発現が亢進しているマイクロRNA7種類を新たなバイオマーカーの候補分子として同定した。次に、51例（播種陽性12例、陰性39例）でこれらの発現をRT-PCR法にて定量し、4種類のmicroRNA (miR-21-5p, miR-92a-3p, miR-223-3p, and miR-342-3p)が播種陽性症例で有意に増加しており、陽性群でPeritoneal cancer Index (PCI) scoreと正の相関を示すことを確認した。また、腹腔内化学療法を施行した患者において、臨床経過とこれらのmicroRNAの推移を比較検討すると、miR-21-5p とmiR-223-3pが播種の病態と特に良好な相関を示し、播種治療におけるバイオマーカーとなりうると考えられた。
（３）癌性腹水検体において、1～5 microg/mlの濃度で、CD9およびCD63抗体を作用させたのち、磁気カラムを通過させることで、ほぼ90％のエクソソーム分画が除去されることを確認した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
（１）腹膜播種陽性胃癌患者14例と陰性患者11例から開腹時に洗浄腹水を採取、超遠心法にてエクソソームを分離し、内包されるmicroRNAを単離することに成功した。このmicroRNAサンプルからを用いて網羅的な発現解析を行い、播種陽性群では56種、播種陰性群では54種のmicroRNAを同定し、これらのマイクロRNAのカスタムアレーを作成、これを用いて播種陽性群で有意に発現が亢進しているmicroRNA 8個と低下しているmicroRNA 3個を同定した。次に、51例（播種陽性12例、陰性39例）のvalidation cohortにて、これらのmicroRNAの発現をRT-PCR法にて定量し、4種類のmicroRNA (miR-21-5p, miR-92a-3p, miR-223-3p, and miR-342-3p)が播種陽性症例で有意に増加しており、陽性群でPeritoneal cancer Index (PCI) scoreと正の相関を示すことを確認した。さらに、腹腔内化学療法を施行した患者において、臨床経過とこれらのmicroRNAの推移を比較検討すると、miR-21-5p とmiR-223-3pが播種の病態と特に良好な相関を示し、播種治療におけるバイオマーカーとなりうることを示唆する知見を得た。
（２）癌性腹水検体において、二種類の抗体を様々な濃度で作用させたのち、磁気カラムを通過させ、エクソソームの除去効率を測定、最も効率的な条件を決定するという目標を達成した。
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| Strategy for Future Research Activity |
新たなコホート群で、4種類のmicroRNA (miR-21-5p, miR-92a-3p, miR-223-3p, and miR-342-3p)の定量値と臨床病理学的因子との相関関係を検討する。また、腹腔内化学療法症例で経時的に腹腔内液を採取した例で、miR-223-3p, miR-21-5pの推移を臨床経過、血中腫瘍マーカーの推移と比較検討し、従来のマーカーに対する優越性を見出せるかどうかを検証する。
また、miR-223-3pとmiR-21-5pの分子機能を明らかにすることに取り組む。癌性腹水由来のエクソソームを各種培養細胞、免疫細胞に添加し、それらの細胞機能への影響をIn vitroの実験系で詳細に検討するとともに、特異的なinhibitorを対象細胞に添加し、その影響がキャンセルされるかどうか？を確認する。その結果から、これらのマイクロRNAが播種癌細胞の形質および腹腔局所の微小環境をどう制御しているのか？を明らかにし、現在進行しているエクソソームの表面分子の発現解析とあわせて腹膜播種に対する新たな治療戦略を見出す
新たに、現在ウイルス除去に用いられている濾過膜を用いてエクソソーム除去濃縮腹水を作成する方法を試み、抗体によるエクソソーム除去法との効率、実用性を比較検討することで最適なCARTシステムを模索する。
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[Presentation] A phase II study of perioperative intraperitoneal paclitaxel plus S-1/paclitaxel for curatively resectable gastric cancer with serosal invasion: The GAPS study.2018
Author(s)
Seiji Ito, Motohiro Imano, Yoshikazu Uenosono, Takaaki Arigami, Hiroshi Yabusaki, Yasuo Hirono, Shugo Ueda, Tatsuki Matsumura, Ryoji Fukushima, Atsushi Takeno, Kentaro Kishi, Yasutaka Chiba, Sachi Chiba, Haruhiko Imamoto, Yuichi Ito, Atsushi Matsuki, Hironori Ishigami, Hironori Yamaguchi, Joji Kitayama,et al.
Organizer
USA(Chicago)
Int'l Joint Research
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[Presentation] Phase II study of ip PTX + S-1/PTX for gastric cancer with positive peritoneal cytology2018
Author(s)
Motohiro Imano, Hironori Ishigami, Hiroshi Yabusaki, Haruhiko Imamoto, Hiroharu Yamashita, Kentaro Kishi, Yasuhiro Kodera, Yoshikazu Uenosono, Yoshiyuki Fujiwara, Akio Hidemura, Shigeyuki Tamura, Ryoji Fukushima, Hironori Yamaguchi, Joji Kitayama and Japan intraperitoneal chemotherapy study group (JIPG)
Organizer
第90回日本胃癌学会総会
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[Presentation] 腹膜播種を伴う胃癌に対するS-1/CDDP+パクリタキセル腹腔内投与併用の第II相臨床試験2018
Author(s)
小林大介, 太田光彦, 福島亮治, 伏田幸夫, 上田修吾, 楠本哲也, 秀村晃生, 山下直行, 藪崎裕, 大森健, 有上貴明, 石神浩徳, 北山丈二, 小寺泰弘, 腹腔内化学療法研究会
Organizer
第56回日本癌治療学会学術集会
