好中球免疫を利用した肺炎球菌の肺炎重症化メカニズムと制御法の分子検索

2018 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 17H04367
• Research Institution: Niigata University
• Principal Investigator: 寺尾 豊 新潟大学, 医歯学系, 教授 (50397717)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 土門 久哲 新潟大学, 医歯学系, 助教 (00594350) ; 前川 知樹 新潟大学, 医歯学系, 研究准教授 (50625168)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: 肺炎球菌

Outline of Annual Research Achievements

計画2年目は前年度に引き続き，まずELISAやLuminex解析を継続した．そして，順次，得られたデータを基にして，以下の実験項目を代表者および分担者がペア院生を教育しながら遂行した．
項目：傷害を受けた好中球から漏出する分子のヒト組織為害性の検索
(1) 初年度に，好中球内部から肺炎球菌により漏出することを同定したサイトカインや傷害マーカー，あるいはプロテアーゼ類をAKTA自動カラムクロマトグラフィー装置で精製した（また別途に，専用のキットにて調整したエクソソームやゲノム断片等も含む）．好中球の細胞数が少なく，以降の実験に必要なサイトカインやプロテアーゼ等が精製できない場合は，製品で同等品を購入した．(2) ヒト肺胞上皮細胞株およびヒトのマクロファージ様細胞株に，手順(1)で調整した好中球内部のプロテアーゼ等を添加し，ヒト組織への傷害性ならびに機能抑制能を分析した．細胞傷害はLDH遊離量から算出し，マクロファージ様細胞の機能抑制はpHRodoラベル細菌（MolecularProbe社製品）を貪食させて定量した．(3) バックアップ計画：好中球内部には，病原細菌を捕獲しファゴソーム膜に取り込んだ後に，リソソームから分泌され 病原細菌を分解するエラスターゼや細胞膜傷害ペプチドLL-37が存在する．エラスターゼやLL-37は，試薬メーカーから販売されているため，市販のエラスターゼおよびLL-37をヒト肺胞上皮細胞株およびヒトのマクロファージ様細胞株に添加し，組織傷害性等を検索した．
(1)および(2)の結果は， Front. Immunol., April Vol. 9, Article 732, eCollection, 2018／Cell. Immunol., 325: 14-22, 2018／Vaccine, 37: 160-168, 2019にて国際論文として公表した．

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本研究では，他の細菌では認められない「肺炎球菌のユニークな特徴である自己溶菌」に着目し，『肺炎球菌が戦略的に好中球を集積・傷害し，好中球内容物を感染拡大や肺炎球菌の増殖と免疫回避に役立てる』と仮説を立て計画した．その仮説機序から，肺炎の重症化を制御するアイデアとして，教科書的にはヒトの防御因子と記載されている好中球の機能を抑制する発案をした．今年度は，順調にこの逆転的で独創的な発案を科学的に証明できた．さらに，次年度の最終年に備え，同定した因子を用いた感染制御法の予備的な実験検索も推進することができている．これらの結果として，申請調書に記した以下の「5点の具体的な目標設定」のうち，(a) 肺炎球菌が自己溶菌することで，内部から漏出する病原因子群を同定する．(b) 好中球に作用する肺炎球菌の漏出分子を 細胞傷害/免疫撹乱/貪食阻害能に分けて調べる．(c) 傷害を受けた好中球から漏出する分子群をサイトカイン/プロテアーゼ/傷害マーカーに分け，肺胞上皮細胞およびマクロファージ等への為害性を調べる．の3点までを論文発表することができている．すなわち，Front. Immunol., April Vol. 9, Article 732, eCollection, 2018／Cell. Immunol., 325: 14-22, 2018／Vaccine, 37: 160-168, 2019である．次いで，[2] 誤嚥性肺炎の分子制御に向けて，日本歯科評論，ヒョーロン・パブリッシャーズ社，79(5): 156-158, 2019にて，広く歯科医療従事者にも発表した．さらに，新聞やインターネットで研究成果が複数掲載され，専門領域内外の研究者および国民に広く情報発信も行えた．

Strategy for Future Research Activity

最終年度は，申請調書に従い，以下の計画を推進する．
＜好中球内部の分子と肺炎球菌由来の病原因子の相互作用解析＞
(1) 肺炎球菌の内部から自己溶菌により漏出した病原因子が，好中球に傷害を及ぼして細胞内部のヒト分子を漏出した後，細菌とヒトの分子同士が結合し，新たな組織傷害能を有する可能性を検索する．具体的には，肺炎球菌の内部に局在するシャペロン分子，およびDNA結合タンパク質を組換え体で作製し，好中球から抽出したゲノムDNAと反応させる．Biacore装置を用いて，複合体形成が確認できれば，複合体をヒト肺胞上皮細胞株およびヒトのマクロファージ様細胞株に添加し，組織傷害性や細胞増殖の阻害能等を検索する．(2) 肺炎球菌の内在性タンパク質を作用させ好中球を破壊し（肺炎球菌の細胞傷害毒素をバックアップ分子とする），その内部から得られた画分を肺炎球菌の培養時に添加する．ヒト由来の成分の有無で，肺炎球菌の増殖速度を比較する．(3) 手順(2)の際，肺炎球菌が菌体表層にヒト分子を結合させることができれば，ヒト免疫系からの認識を逃れる「分子擬態」を果たす可能性が考えられる．手順(2)のサンプルの一部をマクロファージ様細胞と混和し，未処理の肺炎球菌との貪食回避率の有意差をプレート培養法で比較する．
＜In vitro解析を基にした肺炎球菌感染の制御法の検索＞
(4) 上記(3)までの解析で，好中球内部のプロテアーゼ漏出が肺胞やマクロファージへの傷害を起こすことが示されれば，プロテアーゼ阻害剤をLDH測定の反応系に添加し，組織傷害の軽減割合を観察・測定する．バックアップ計画として：好中球内のエラスターゼは，システイン プロテアーゼに分類される．システイン プロテアーゼを阻害する臨床薬として，エラスポールやシベルスタットが販売されている．これら臨床阻害剤を手順(1)に供する．

Research Products

• [Journal Article] Immunization with pneumococcal elongation factor Tu enhances serotype-independent protection against Streptococcus pneumoniae infection. (2019)
  • Author(s): Nagai K, Domon H, Maekawa T, Hiyoshi T, Tamura H, Yonezawa D, Habuka R, Saitoh A, Terao Y
  • Journal Title: Vaccine Volume: 37 Pages: 160-168
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Antibacterial activity of hinokitiol against both antibiotic-resistant and -susceptible pathogenic bacteria predominant in the oral cavity and upper airways. (2019)
  • Author(s): Domon, H., Hiyoshi, T., Maekawa, T., Yonezawa, D., Tamura, H., Kawabata, S., Yanagihara, K., Kimura, O., Kunitomo, E., and Terao, Y.
  • Journal Title: Microbiol. Immunol. Volume: 印刷中 Pages: 印刷中
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Aggregatibacter actinomycetemcomitans induces detachment and death of human gingival epithelial cells and fibroblasts via elastase release following leukotoxin-dependent neutrophil lysis. (2019)
  • Author(s): Hiyoshi, T., Domon, H., Maekawa, T., Nagai, K., Tamura, H., Takahashi, N., Yonezawa, D., Miyoshi, T., Yoshida, A., Tabeta, K., and Terao, Y.
  • Journal Title: Microbiol. Immunol. Volume: 印刷中 Pages: 印刷中
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] The AmyI-1-18 peptide derived from rice inhibits alveolar bone resorption via suppression of inflammatory cytokine production induced by lipopolysaccharide and interleukin-1beta. (2019)
  • Author(s): Aoki-Nonaka, Y., Tabeta, K., Yokoji, M., Matsugishi, A., Matsuda, Y., Takahashi, N., Sulijaya, B., Domon, H., Terao, Y., Taniguchi, M., and Yamazaki, K.
  • Journal Title: J. Periodontol. Volume: 印刷中 Pages: 印刷中
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Antimicrobial susceptibility of Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, and Moraxella catarrhalis clinical isolates from children with acute otitis media in Japan from 2014 to 2017. (2019)
  • Author(s): Nagai, K., Kimura, O., Domon, H., Maekawa, T., Yonezawa, D., and Terao, Y.
  • Journal Title: J. Infect. Chemother. Volume: 25(3) Pages: 229-232
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Peptides from rice endosperm protein restrain periodontal bone loss in mouse model of periodontitis. (2019)
  • Author(s): Tamura, H., Maekawa, T., Domon, H., Hiyoshi, T., Yonezawa, D., Nagai, K., Ochiai, A., Taniguchi, M., Tabeta, K., Maeda, T., and Terao, Y.
  • Journal Title: Arch. Oral Biol. Volume: 98 Pages: 132-139
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Repeated human deciduous tooth-derived dental pulp cell reprogramming factor transfection yields multipotent intermediate cells with enhanced iPS cell formation capability. (2019)
  • Author(s): Soda, M., Saitoh, I., Murakami, T., Inada, E., Iwase, Y., Noguchi, H., Shibasaki, S., Kurosawa, M., Sawami, T., Terunuma, M., Kubota, N., Terao, Y., Ohshima, H., Hayasaki, H., and Sato, M.
  • Journal Title: Scientific Reports Volume: 9 Pages: 1490
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Mechanism of macrolide-induced inhibition of pneumolysin release involves impairment of autolysin release in macrolide-resistant Streptococcus pneumoniae. (2018)
  • Author(s): Domon, H., Maekawa, T., Yonezawa, D., Nagai, K., Oda, M., Yanagihara, K., and Terao, Y.
  • Journal Title: Antimicrob. Agents Chemother. Volume: 62(11) Pages: e00161-18
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Streptococcus pyogenes CAMP factor promotes calcium ion uptake in RAW264.7 cells. (2018)
  • Author(s): Kurosawa, M., Oda, M., Domon, H., Isono, T., Nakamura, Y., Saitoh, I., Hayasaki, H., Yamaguchi, M., Kawabata, S., and Terao, Y.
  • Journal Title: Microbiol. Immunol. Volume: 62 Pages: 617-623
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Neutrophil elastase subverts the immune response by cleaving toll-like receptors and cytokines in pneumococcal pneumonia. (2018)
  • Author(s): Domon, H., Nagai, K., Maekawa, T., Oda, M., Yonezawa, D., Takeda, W., Hiyoshi, T., Tamura, H., Yamaguchi, M., Kawabata, S., and Terao, Y.
  • Journal Title: Front. Immunol. Volume: Vol. 9 Pages: Article 732
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Sulfated vizantin induces the formation of macrophage extracellular traps. (2018)
  • Author(s): Oda, M., Kurosawa, M., Yamamoto, H., Domon, H., Kimura, T., Isono, T., Maekawa, T., Hayashi, N., Yamada, N., Furue, Y., Kai, D., and Terao, Y.
  • Journal Title: Microbiol. Immunol. Volume: 62 Pages: 310-316
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] The effect of chlorhexidine on dental calculus formation: an in vitro study (2018)
  • Author(s): Sakaue, Y., Takenaka, S., Ohsumi, T., Domon, H., Terao, Y., and Noiri, Y.
  • Journal Title: BMC Oral Health Volume: 18 Pages: 52
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] treptococcal cysteine protease-mediated cleavage of desmogleins is involved in the pathogenesis of cutaneous infection. (2018)
  • Author(s): Sumitomo, T., Mori, Y., Nakamura, Y., Honda-Ogawa, M., Nakagawa, S., Yamaguchi, M., Matsue, H., Terao, Y., Nakata, M., and Kawabata, S.
  • Journal Title: Front. Cell. Infect. Microbiol. Volume: Vol. 8 Pages: Article 10
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Pneumococcal DNA-binding proteins released through autolysis induce the production of proinflammatory cytokines via toll-like receptor 4. (2018)
  • Author(s): Nagai, K., Domon, H., Maekawa, T., Oda, M., Hiyoshi, T., Tamura, H., Yonezawa, D., Arai, Y., Yokoji, M., Tabeta, K., Habuka, R., Saitoh, A., Yamaguchi, M., Kawabata, S., and Terao, Y.
  • Journal Title: Cell. Immunol. Volume: 325 Pages: 14-22
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] treptococcus pyogenes CAMP factor promotes bacterial adhesion and invasion in pharyngeal epithelial cells without serum via PI3K/Akt signaling pathway. (2018)
  • Author(s): Kurosawa, M., Oda, M., Domon, H., Isono, T., Nakamura, Y., Saitoh, I., Hayasaki, H., Yamaguchi, M., Kawabata, S., and Terao, Y.
  • Journal Title: Microb. Infect. Volume: 20 Pages: 9-18
  • Peer Reviewed
• [Presentation] Local regulator Del1 inhibits bone-resorption via suppression of Wnt5a-Ror2 signaling axis. (2018)
  • Author(s): Maekawa T, Domon H, Kobayashi K, Nagai K, Yonezawa D, Maeda T, Hajishengallis G, Terao Y.
  • Organizer: he ASBMR 2018 Annual Meeting
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] 内因性抗炎症Del-1分子誘導による炎症性骨破壊の新規治療戦略 (2018)
  • Author(s): 前川知樹，土門久哲，田村 光，日吉 巧，寺尾 豊，前田健康
  • Organizer: 第61回秋季日本歯周病学会学術大会
• [Presentation] 腔および上気道の病原細菌に対するヒノキチオールの抗菌作用解析 (2018)
  • Author(s): 土門久哲，國友栄治，寺尾 豊
  • Organizer: 第60回歯科基礎医学会学術大会
• [Presentation] 炎症および骨吸収の制御作用を有する新規食物由来ペプチドの検索 (2018)
  • Author(s): 田村 光，前川知樹，土門久哲，永井康介，日吉 巧，前田健康，寺尾 豊
  • Organizer: 第60回歯科基礎医学会学術大会
• [Presentation] Local regulator Del1 inhibits bone-resorption via suppression of Wnt5a-Ror2 signaling axis. (2018)
  • Author(s): Maekawa T, Domon H, Kobayashi K, Nagai K, Yonezawa D, Terao Y, Maeda T, Hajishengallis G.
  • Organizer: 96th General Session & Exhibition of the IADR
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] 内因性抗炎症分子Del-1分子誘導による炎症性骨破壊の新規治療戦略 (2018)
  • Author(s): 前川知樹，小林泰浩，土門久哲，田村 光，日吉 巧，永井康介，寺尾 豊，前田健康
  • Organizer: 第4回日本骨免疫学会
• [Presentation] 食物由来ペプチドを用いた炎症と骨吸収の制御法の検索 (2018)
  • Author(s): 田村 光，前川知樹，米沢大輔，土門久哲，永井康介，日吉 巧，多部田康一，前田健康，寺尾 豊，吉江弘正
  • Organizer: 第61回春季日本歯周病学会学術大会
• [Presentation] Aggregatibacter actinomycetemcomitansによる歯周組織破壊メカニズムの解析 (2018)
  • Author(s): 日吉 巧，土門久哲，永井康介，前川知樹，高橋直紀，米沢大輔，田村 光，吉田明弘，寺尾 豊，吉江弘正
  • Organizer: 第61回春季日本歯周病学会学術大会
• [Presentation] 肺炎球菌性肺炎の重症化メカニズムの解析－新規肺炎制御法への展開－ (2018)
  • Author(s): 土門久哲，永井康介，前川知樹，山口雅也，川端重忠，寺尾 豊
  • Organizer: 第6回五大学・口腔微生物研究会
• [Presentation] Aggregatibacter actinomycetemcomitansが産生するロイコトキシンによる歯周組織破壊メカニズムの解析 (2018)
  • Author(s): 日吉巧，土門久哲，永井康介，前川知樹，高橋直紀，米澤大輔，田村光，吉田明弘，寺尾 豊
  • Organizer: 第6回五大学・口腔微生物研究会
• [Presentation] 肺炎球菌とマクロライド：新潟市内の耐性菌分離率と病原性抑制作用の解析 (2018)
  • Author(s): 土門久哲，前川知樹，永井康介，栁原克紀，木村 征，寺尾 豊
  • Organizer: 第57回新潟化学療法研究会学術講演会
• [Presentation] マクロライド耐性肺炎球菌に対するマクロライド系抗菌薬の作用解析 (2018)
  • Author(s): 土門久哲，前川知樹，永井康介，栁原克紀，木村 征，寺尾 豊
  • Organizer: 第25回マクロライド新作用研究会
• [Presentation] 内因性抗炎症分子Del-1を介したマクロライド系抗菌薬の新作用機序 (2018)
  • Author(s): 前川知樹，土門久哲，寺尾 豊
  • Organizer: 第25回マクロライド新作用研究会
• [Book] 日本歯科評論：米ペプチドを用いた歯槽骨吸収の抑制 (2019)
  • Author(s): 寺尾 豊
  • Total Pages: 190
  • Publisher: ヒョーロン・パブリッシャーズ社
• [Book] 日本歯科評論：誤嚥性肺炎の分子制御に向けて (2019)
  • Author(s): 寺尾 豊
  • Total Pages: 182
  • Publisher: ヒョーロン・パブリッシャーズ社
• [Book] 日本歯科評論：歯周病における歯肉細胞損傷メカニズムとその制御研究 (2019)
  • Author(s): 寺尾 豊
  • Total Pages: 印刷中
  • Publisher: ヒョーロン・パブリッシャーズ社
• [Book] パーフェクトマスター口腔微生物学・免疫学 (2018)
  • Author(s): 寺尾 豊
  • Total Pages: 93
  • Publisher: 医歯薬出版
• [Book] 微生物学，歯科衛生士 歯科衛生士書き込み式学習ノート① (2018)
  • Author(s): 寺尾 豊
  • Total Pages: 298
  • Publisher: 医歯薬出版
• [Remarks] 肺炎球菌の病原因子および細菌性肺炎重症化機構の解析
  • URL: https://nu-mid.net/study/index4.html