2018 Fiscal Year Annual Research Report
ラット歯髄組織再生モデルを用いた再生過程の解析：幹細胞分化促進因子の探索
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17H04380
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| Research Institution | Tokyo Medical and Dental University |
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Principal Investigator |
興地 隆史 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 教授 (80204098)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
勝部 憲一 東都医療大学, ヒューマンケア学部, 教授 (20233760)
大島 勇人 新潟大学, 医歯学系, 教授 (70251824)
金子 友厚 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 講師 (70345297)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 歯学 / 歯内療法学 / 歯髄再生 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
申請者らは、生活断髄後の歯冠歯髄腔にラット骨髄間葉系幹細胞とポリ乳酸/Matrigelスキャホールドを移植する手法を用い、dentin bridgeを有する歯髄様組織が約２週間で再生可能なラット臼歯歯冠歯髄再生モデルを確立している。本研究課題は、同モデルが歯髄組織再生に関与する細胞・分子機構の探索や効率的な歯髄再生技法の確立に有用であることに着目し、組織再生過程での幹細胞の分化や組織再生の様相を形態学的ならびに遺伝子・タンパク発現から解析し、組織再生の促進に主要な役割を演じる因子の同定を行うことを目的とする。
前年度は、上記のモデルを用いた再生歯髄組織の評価と再生促進因子の解析を目的として、以下の実験を実施した。実験動物として雌性Wistarラットを用い、ラット骨髄間葉系幹細胞単独、もしくはこれと血管内皮細胞を混合したものをMatrigelに混濁させ、ゲル状スキャホールドを作成したのち、これをPLLAスキャホールド上に添加して三次元スキャホールドを作成した。ラット上顎第一臼歯歯冠歯髄歯髄腔に幹細胞添加三次元スキャホールドを埋入し、窩洞をmineral trioxide aggregateで封鎖した。移植期間は3, 7, 14日とし、再生歯髄組織の免疫組織学的観察、ウェスタンブロット法を用いたタンパク発現解析および歯髄組織再生の促進に関連のある遺伝子のマイクロアレイ解析を行い、以下の結果を得た。
1.幹細胞、血管内皮細胞混合移植で組織再生が促進することを確認するとともに、LacZ遺伝子導入幹細胞が移植14日後においても新生硬組織形成部近傍で選択的に集積を示すことを見出した。
2. 骨髄間葉系幹細胞・血管内皮細胞混合移植の再生促進効果に関係のある遺伝子として、血管新生関連遺伝子（B-cell lymphoma 2、nuclear factor-kappa Bなど)が同定された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当該年度における研究計画と、おおむね同様の内容で研究は遂行された。すなわち、ラット臼歯歯冠歯髄再生モデルを用い、上顎第一臼歯歯冠歯髄歯髄腔に再生した歯髄様組織を対象として、マイクロアレイを用いた遺伝子発現解析、免疫組織化学的染色法を用いた細胞や神経線維における特異的タンパク発現の解析、さらには、ウェスタンブロット法を用いた再生歯髄様組織における各種タンパク発現の解析を行った。
主な研究成果としては、骨髄間葉系幹細胞、血管内皮細胞混合移植を行った場合、骨髄間葉系幹細胞単独移植と比較して組織再生が促進されることを確認するとともに、この現象に関連する遺伝子をマイクロアレイにて解析し、血管新生への関連が知られるB-cell lymphoma 2やnuclear factor-kappa Bを同定することができた。さらに、LacZ遺伝子を導入した骨髄幹細胞を同モデルに移植したところ、術後２週経過後においてもこれらが新生硬組織形成部近傍で選択的に集積を示すことが確認され、移植された骨髄間葉系幹細胞が再生組織中で生存するのみならず、新生硬組織形成細胞への分化を示す可能性が示唆された。
また、ラット切歯からの幹細胞分取にも成功しており、これらを用いた組織再生の様相についても同様な解析が進行している。
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| Strategy for Future Research Activity |
前年度に引き続きラット歯冠歯髄再生モデルを用い、骨髄間葉系幹細胞あるいは歯髄幹細胞を用いた歯髄組織再生の促進に関連のある遺伝子やタンパクの発現解析を継続して行う。
すなわち、前年度にマイクロアレイ解析にて同定した歯髄組織再生促進関連遺伝子(B-cell lymphoma 2あるいはnuclear factor-kappa Bなど）をエレクトロポレーション法で形質導入し、これらの発現を上方あるいは下方制御した幹細胞（ラット切歯歯髄幹細胞およびラット骨髄間葉系幹細胞）を作成したのち、これらをラット臼歯歯冠歯髄再生モデルに適用し、歯髄再生の促進・遅延が生じるかを組織学的、免疫組織化学的に検証することにより、歯髄再生促進に最も関与すると考えられる遺伝子を選択する。
また、これまでの成果が全部歯髄組織再生に適用できるかについても検索を開始する。すなわち、ラット上顎第一臼歯の歯冠歯髄を除去後、近心根を抜髄し、根管内に幹細胞添加ゲル状スキャホールドを注入後、冠部歯髄腔に幹細胞添加三次元スキャホールドを埋入し、窩洞をMTAで封鎖する。3, 7, 14, 28日後に被験歯を組織学的、免疫組織化学的観察に供し、歯根歯髄の再生状態を評価する。
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Research Products
(14 results)
