2018 Fiscal Year Annual Research Report
組織マクロファージによる歯髄微小環境調節機構の解明と歯髄組織再生法の開発
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17H04400
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| Research Institution | Matsumoto Dental University |
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Principal Investigator |
中村 浩彰 松本歯科大学, 歯学部, 教授 (50227930)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
二宮 禎 日本大学, 歯学部, 准教授 (00360222)
宇田川 信之 松本歯科大学, 歯学部, 教授 (70245801)
細矢 明宏 北海道医療大学, 歯学部, 准教授 (70350824)
堀部 寛治 松本歯科大学, 歯学部, 助教 (70733509)
雪田 聡 静岡大学, 教育学部, 准教授 (80401214)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | マクロファージ / 歯髄 / 修復象牙質 / Wntシグナル / 歯髄再生療法 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
マウスの上顎第一臼歯におけるMTAセメントを用いた直接覆髄後の治癒過程におけるM2マクロファージの関与を明らかにするために、μCTにて硬組織形成の有無を確認後、パラフィン切片にて、免疫組織化学的にWnt3a、Wnt10a、β-catenin、Osterix 、F4/80の局在を検出した。μCT所見により、覆髄後１４日からに不透過像が確認され、２８日後には覆髄部直下にデンティンブリッジが形成されていた。組織学的観察によりデンティンブリッジは既存の象牙芽細胞により形成されたreactionary dentinとreparative dentinから構成され、後者は直接覆髄後に歯髄細胞から分化した修復象牙芽細胞により形成されると考えられた。デンティンブリッジ直下の象牙芽細胞および修復象牙芽細胞の核はβ-catenin、Osterix陽性を示し、その分化過程初期には象牙芽細胞由来のWnt3a、Wnt10aが重要な役割を担っていることがわかった。また、蛍光二重染色により歯髄内に出現するF4/80陽性マクロファージがWnt10aを発現することが明らかとなり、象牙芽細胞の活性化および歯髄細胞から修復象牙芽細胞への分化過程にマクロファージ由来のWnt10aが関与している可能性が示唆された。デンティンブリッジを構成するreactionary dentin形成には象牙芽細胞由来のWnt3aとWnt10aの重要性が示唆されたことから、歯髄細胞を用いたin vitro系での検討を行った。マウス切歯から歯髄細胞を分離し、歯髄細胞から修復象牙芽細胞への分化過程におけるWntリガンド発現をreal-time PCRにより解析したところ、分化マーカーであるDSPP発現上昇に伴い、Wnt3aとWnt10aが上昇することが明らかとなった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
マウス臼歯の直接覆髄モデルを用いて修復象牙質形成過程におけるWntリガンドおよびマクロファージの関与について解析した。M2マクロファージのマーカーのうち、CD206についてはでパラフィン切片に免疫染色に有用な市販抗体を入手でき検討したところ、Wnt10aを発現するマクロファージはCD206陰性であることがわかり、従来の分類による組織修復型マクロファージとは異なることがわかった。Wnt10a発現マクロファージは組織修復に関連するM2マクロファージではないかと推測したが、これまでの分類とは異なるマクロファージのサブタイプに属するものと考えられた。また、直接覆髄後１４日の歯髄組織からmRNAを回収してWnt関連遺伝子の発現をreal-time PCRにて試みたところ、Wnt10aについては上昇している傾向はみられたが、mRNAの回収効率に問題があり、統計学的に有意差を認めるまでには至っていない。現在、新たな試薬を用いて回収効率の向上に努めている。
象牙芽細胞分化におけるWntリガンドの役割をin vitroで明らかにするために、マウス切歯から歯髄細胞を採取し、石灰化誘導培地にて培養し７日でアリザリンレッド陽性の石灰化基質が誘導された。この実験系においてDSPP発現上昇に伴い、Wnt3aとWnt10a発現を確認し、象牙芽細胞分化における内在性のWntシグナルの重要性が示唆された。
Gli1-Cre-ERT2-Tomatoマウスを入手し、タモキシフェン投与しGli1発現細胞を検出したところ、歯根膜比較して少ないものの、臼歯歯髄中にもGli1陽性細胞が存在することがわかった。しかし、このマウスを用いた直接覆髄の実験を着手していない。
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| Strategy for Future Research Activity |
Wnt10aを発現するマクロファージがこれまでM2マクロファージのマーカーとして報告されているCD206を発現していなかったことから、新たな組織修復型マクロファージである可能性がある。そこで、M1マクロファージのマーカーであるCD86およびもう一つのM2マクロファージのマーカーであるCD163発現についても有用な抗体を入手して免疫組織学的に解析する。また、マクロファージにおけるWnt10a発現機構については株化マクロファージであるRAW264.7細胞または骨髄マクロファージにMTAセメントを取り込ませて、Wnt10aおよび他のWntリガンドの発現について検討する。さらに、刺激後に上昇するWnt 以外の成長因子についても探索する。
マウス切歯を用いた歯髄細胞の培養系が確立できたことから、Wntシグナル阻害剤を添加し象牙芽細胞分化が抑制されるかについて、DSPP発現をマーカーに検討する。また、マクロファージとの共存培養系を構築し、マクロファージ刺激により歯髄細胞から象牙芽細胞への分化が促進されるか否かについても解析する。さらに、Wnt/β-カテニンシグナルおよびマクロファージ由来成長因子により活性化されるシグナル伝達系を明らかにし、これを活性化する低分子化合物をスクリーニングし、直接覆髄剤への応用についても探索する。
In vivo系による修復象牙質形成については、Gli1-Cre-ERT2-Tomatoマウスを用いてMTAセメントの直接覆髄後における、歯髄細胞から修復象牙芽細胞分化する過程について細胞系譜解析を行う。
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