2017 Fiscal Year Annual Research Report
Exploration and development of cold-adapted microorganisms useful in low-temperature biotechnology for chemical production and environmental conservation
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17H04598
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
栗原 達夫 京都大学, 化学研究所, 教授 (70243087)
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2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 好冷性微生物 / 物質生産 / タンパク質生産 / タンパク質分泌生産 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
(1) 低温環境に生息する魚類腸内容物から単離したPseudoalteromonas nigrifaciens Sq02株について、本菌を宿主としたタンパク質低温生産系を構築した。本菌は4 °Cから18 °Cで良好に生育し、ほぼ単一の主要分泌タンパク質として機能未知タンパク質P320を培養上清に生産する。P320遺伝子のプロモーターを広宿主域プラスミドに組み込み、その下流にβ-ラクタマーゼ、好冷菌Desulfotalea psychrophila DSM12343由来のタンパク質PepF、LAP、PepQ、BglAの遺伝子を挿入した。得られたプラスミドを接合伝達によってSq02株に導入し、これらのタンパク質の低温での生産を試みた。その結果、低温菌Shewanella livingstonensis Ac10を宿主とする既存のタンパク質低温生産系よりも高い生産性が認められた。一方、P320のC末端にPepF、LAP、PepQ、BglAを融合したタンパク質の遺伝子を組み込んだプラスミドをSq02株に導入すると、培養液上清に融合タンパク質が分泌された。PepF、LAP、PepQ、BglAの分泌生産量は、18 °Cにおいてそれぞれ55 mg/L、79 mg/L、31 mg/L、77 mg/L、4 °Cにおいてそれぞれ22 mg/L、37 mg/L、15 mg/L、37 mg/Lとなり、P320を利用することで、異種タンパク質の低温分泌生産が可能であることが示された。
(2) 南極海水から単離した低温菌S. livingstonensis Ac10を宿主として、発現制御可能なタンパク質低温生産系を構築した。trpオペロンプロモーター制御下のレポーター遺伝子について、L-Trp添加による発現抑制、trpリプレッサー阻害剤添加による発現誘導が可能であることを見いだした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
タンパク質分泌生産能に優れた好冷性微生物を宿主として外来タンパク質を低温で分泌生産するシステムを構築することに成功した。これにより、生産された外来タンパク質の単離精製が容易になることが期待される。また、好冷性微生物を宿主とした発現制御可能なタンパク質低温生産システムを開発した。外来タンパク質の発現を抑制した状態で宿主細胞を培養することが可能になり、特に毒性をもった外来タンパク質の生産などに有用と期待される。一方、分泌生産システムについては生産性の改善やキャリアタンパク質の除去といった課題が残されており、発現制御可能な生産システムについては発現抑制効率の改善といった課題が残されていることから、「おおむね順調に進展している」と評価することが妥当と考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
引き続き新しい有用好冷性微生物の探索を行う。特にタンパク質分泌生産能に優れた微生物や、熱処理による宿主由来タンパク質の変性除去が容易な微生物（熱処理による外来タンパク質の純度向上が可能な微生物）の探索を重点的に行う。開発中のタンパク質低温分泌生産システムについては、分泌機構の解明に基づく分泌効率の改善とキャリアタンパク質除去方法の検討を行う。発現制御可能なタンパク質低温生産システムについては、さらに強力な発現抑制が可能なプロモーターの探索を行う。
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