2017 Fiscal Year Annual Research Report
内耳増幅の超分子メカニズム解明を目指した膜タンパク質操作・計測技術と新機能の創生
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17H04739
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| Research Institution | Kagoshima University |
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Principal Investigator |
村越 道生 鹿児島大学, 理工学域工学系, 准教授 (70570901)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | プレスチン / 外有毛細胞 / 内耳 / 聴覚 / タンパク質モーター / 原子間力顕微鏡 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究課題では，内耳の感覚細胞に発現する“プレスチン（prestin）”に着目し，その構造と機能を自在に制御する技術とこれを捉える計測技術の開発に取り組むことで，音受容メカニズムの解明及びそのユニークな機能を応用した新機能（ナノバイオデバイス）の創生を目指す．この目標達成に向け，（１）「膜タンパク質発現・精製（採る）」，（２）「電気-機械変換誘導（動かす）」，（３）「分子構造可視化（見る）」，（４）「デバイス化（創る）」の4つの達成目標を設定した．
本年度は（１）に取り組んだ．まず，大量発現用ベクター，高効率精製用ベクター，多機能ベクターの構築に取り組んだ．シークエンス解析の結果，これらのベクターの構築に成功したことを確認した．次に，これらベクターの哺乳類動物細胞（CHO細胞）への導入を試みた．この際，薬剤選択によって安定発現株のスクリーニングも実施した．mRNAの発現確認により，これら遺伝子の導入に成功したことを確認した．現在免疫染色およびウェスタンブロッティングによりに目的タンパク質の発現確認を行っている．
人工脂質膜へのprestin再構成方法についても検討し，精製したprestinをジオレオイルホスファチジルコリン（DOPC）膜中に再構成できることを確認した．しかし，2Lの培養液中に培養した2 × 10^9個の細胞から精製できたタンパク質は約84 μgであり，今後の実験に必要な高密度prestin脂質膜を十分に確保するためには，prestinの高効率精製系の確立が必要であることが示唆された．
高密度prestin脂質膜の構築には至らなかった．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
プレスチンの大量発現系の構築のため，はじめに動物細胞用発現ベクターの構築に取り組んだ．年度内に計画していたベクターの構築は達成したものの，当初予想していたよりもベクター構築に時間を要してしまった．
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| Strategy for Future Research Activity |
初年度に計画していたベクター構築に遅れが生じたものの，現在はCHO細胞への遺伝子導入及び薬剤選択による高発現株の構築を終えており，目的タンパク質の発現確認に取り組んでいる．来年度早期に発現確認を終えると同時に，当初計画で計画していた哺乳類細胞以外の発現系構築については，これらの完成を待たずに，高効率精製系の確立および高密度prestin脂質膜の構築を進めていくことで，計画全体の進捗を図り，当初計画どおり（２）「電気-機械変換誘導（動かす）」に取り組んでいく．
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Research Products
(22 results)
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[Journal Article] Analysis by sweep frequency impedance (SFI) meter of 226-Hz and 1,000-Hz tympanometries in neonates2017
Author(s)
Murakoshi M, Sano K, Kanka N, Yoshida N, Hamanishi S, Kiyokawa H, Kakuta R, Aithal S, Aithal V, Kei J, Driscoll C, Swanston A, Matsutani S, Kobayashi T, Wada H
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Journal Title
Procedia IUTAM
Volume: 24
Pages: 5～14
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
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