2017 Fiscal Year Annual Research Report
Development of innovative and versatile tag-peptide sequences
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17H04887
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| Research Institution | Osaka Prefecture University |
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Principal Investigator |
藤枝 伸宇 大阪府立大学, 生命環境科学研究科, 准教授 (00452318)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 翻訳後化学修飾 / ペプチドタグ / タンパク質修飾 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、標的となるタンパク質・測定対象に与える影響を最小限にしたタグペプチドによるタンパク質標識を目指し、新奇なCross-linked Protein-derived Cofactors (CPDC)を持ったペプチドの開発を行う。金属結合ペプチドにおいて、金属による酸化的自己修飾反応を制御し、翻訳後化学修飾を誘起して自発的に形成される新たなクロモフォア、フルオロフォアを持った人工タグペプチド配列の検索を行う。本研究は、緑色蛍光タンパク質を基盤とした改変とは異なり、10残基程度のペプチドを土台として、自発的に形成される蛍光団や発色団をもつ革新的ペプチドの創製を試みるものである。
金属結合部位として銅もしくはニッケルイオンに対して選択的に結合するATCUN(Amino Terminal Cu(II)- and Ni(II)-binding Motif)配列（X1-X2-His)に着目した。(ATCUN配列はトリペプチドの状態でも銅(II)イオンに対してmM-μMオーダーの解離定数を示す。さらに、タンパク質のN末端に導入された場合、最高で10-11の解離定数を持つ結合能が報告されている。また、ATCUNトリペプチド銅錯体ではDNA酸化的切断活性を示すことからCPDC誘起能を持ち合わせていると考えられる。) 第１段階として、分子量10kDa程度のタンパク質のN末端にこれら配列を結合させ、Niセファロースを用いてその結合から金属結合能を評価した。また、Xの位置のアミノ酸を最適化しながら、アフィニティークロマトグラフィーによるワンステップ精製が可能かどうか判断し、配列のランキングを作成した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度は予備的展開として、まず、反応サイトとなりうる金属結合ペプチド配列を最適化した。計画通り、いくつかのN末配列で金属に結合するものが見られた。順調に次の計画に進めると期待している。
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| Strategy for Future Research Activity |
次年度も引き続き、金属結合部位として銅もしくはニッケルイオンに対して選択的に結合するATCUN(Amino Terminal Cu(II)- and Ni(II)-binding Motif)配列（X1-X2-His)に着目する。第１段階として、分子量10kDa程度のタンパク質のN末端にこれら配列を結合させ、Niセファロースを用いてその結合から金属結合能を評価した。また、Xの位置のアミノ酸を最適化しながら、アフィニティークロマトグラフィーによるワンステップ精製が可能かどうか判断し、金属結合配列の最適化を行う。
結合配列の進捗に合わせてATCUN配列後の数残基に二つのアミノ酸を導入し、その組み合わせと挿入位置を変えることで、天然にはない少なくとも4種類のCPDC形成に挑戦する。天然で見られるCPDCの構造から、自己修飾によって生じた簡単なPDCが二種類の反応経路(Path A:キノンもしくはカルボニル化合物への求核付加反応, Path B:水素原子引き抜きに伴って生じたラジカル分子のラジカルカップリング)で生成すると考えられる。そこで、前者ではCys, His (Lys, Tyr)などの求核性アミノ酸を導入したペプチドを作製し、架橋構造形成の有無を確認する。また、後者では、近傍にTyrやMetを追加導入し、いくつかの金属結合ペプチドの配列を用いるとともに、リンカー部位の配列・長さ(1-3残基, Gly, Ser, Gly-Gly, Gly-Ser, Gly-Gly-Gly, Gly-Gly-Ser)の最適化を行うことで反応効率を向上させる。
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Research Products
(2 results)
