新規順行性神経標識法の確立と、それを用いた記憶神経ネットワークの解明

2017 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 17H04984
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 平野 恭敬 京都大学, 医学研究科, 特定准教授 (40580121)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: 神経回路 / 記憶 / ショウジョウバエ / 順行性標識

Outline of Annual Research Achievements

本研究では、細胞間相互作用に関わるNotchを改変し、シナプス接続のある神経を順行性に標識する手法を開発し、さらに記憶 回路の同定、および操作に活用する。 細胞表面の受容体であるNotchは、隣接する細胞のDelta等のNotchリガンドと結合する。Deltaとの結合により、Notchはγセク レターゼによる切断をうけ、Notchの細胞内ドメインが遊離する。Morsu. L.らはNotchの細胞外ドメイン（受容部）をラクダ由 来の重鎖のみの特殊な抗体であるNanobody（コードする遺伝子は約800bp長）と置換し、さらに細胞内ドメインを転写因子Gal4 と置換した。GFPと結合する抗GFP Nanobody-Notch-Gal4を発現する細胞に、GFPを細胞表面に提示する細胞を隣接させると、GFP と抗GFP Nanobodyが結合することでNotchが切断され、Gal4依存的な蛍光タンパクの発現が誘導されることが示された。この報告では全細胞表面にGFPを提示させていたため、シナプス接続を検討していない。 本年度は上記の手法を改変し、シナプス接続を検出するよう、in vitroで最適化を行ってきた。各ドメインを融合させたコンストラクトを構築し、全長タンパクの位置関係を模索しながら多種のコンストラクトの検討を行った。in vitroの脳初代培養神経を用い、改変型バキュロウィルスを活用することで遺伝子導入し、各コンストラクトの最適化を図った。さらに、Nanobody配列をランダムに変異を導入することで、さらに高感度の標識が可能になるコンストラクトを探索した。In vitroにおいてはこれまで提唱されたコンストラクトの10倍のSN比を示すものを得ることに成功した。次年度はこれら有力候補をin vivoで検証していく。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本研究では、ショウジョウバエ脳神経の初代培養を用いて、１、順行性神経標識法の構築と最適化を図る。続いて、Arc2プロモーターによる記憶神経の同定を活用し、２、順行性神経標識法を使ってキノコ体記憶神経が関与する神経回路を明らかにする。最後に３、順行性神経標識法を応用し、同定した記憶神経回路の活動を操作し、記憶行動への影響を検証する。各項目を1年単位で割り振り、研究を進めていく計画である。現在までに項目１の順行性神経標識法のin vitroでのコンストラクト最適化を行い、候補となるSN比の高いものを得ることができた。順調に進捗していると考えられる。

Strategy for Future Research Activity

順行性神経標識法はこれまでに模索されてきたが、実現されてこなかった方法論である。この方法論を確立すれば、回路レベルで脳を理解する研究には必要不可欠なツールとなりえる。本研究ではショウジョウバエの、特に記憶中枢神経の中でも記憶の貯蔵、あるいは想起に必要な神経を対象にする。それら投射先の神経を理解することで、これまで謎であった記憶に関連する神経回路を網羅的に明らかにすることが期待される。しかしながら、本手法は記憶回路だけでなく、知覚入力や体性感覚の伝達に必要な神経回路すべてに適応可能であると考えている。したがって今後の研究の進捗は、研究者間のコミュニケーションにより発表前に幅広く情報共有し、神経科学の発展に努めることを念頭に進めていく。