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2018 Fiscal Year Annual Research Report

遺伝子修復治療を可能にする正確なゲノム編集技術の開発

Research Project

Project/Area Number 17H04993
Research InstitutionTokyo Metropolitan Institute of Medical Science

Principal Investigator

宮岡 佑一郎  公益財団法人東京都医学総合研究所, 生体分子先端研究分野, プロジェクトリーダー (20549521)

Project Period (FY) 2017-04-01 – 2020-03-31
Keywordsゲノム編集 / HDR / NHEJ / Cas9改変体 / ノックイン / 相同組換え / 非相同末端結合
Outline of Annual Research Achievements

CRISPR/Cas9によるゲノム編集には、相同組換え (HR)、非相同性末端結合(NHEJ)、マイクロホモロジー媒介末端結合(MMEJ)などがある。このうち、HRは、正確で自在なゲノム編集を達成するために非常に有益であるが、その頻度はNHEJやMMEJに比べて極めて低い場合が多い。
前年度までに、eSpCas9(1.1)とSpCas9-HF1という改変型Cas9がHR活性を亢進することを見出していたが、今年度はさらに新たに報告されたHypaCas9という改変型Cas9のHR活性を検討した。その結果、eSpCas9(1.1)やSpCas9-HF1よりも効率よくHRを誘導し、NHEJ/MMEJを抑制することが明らかとなった。また、これまで一塩基置換の導入効率を用いてHR活性を評価していたが、改変したCas9が数千塩基のDNA断片のノックイン効率も同様に向上させるかを検討した。ノックインには野生型Cas9、eSpCas9(1.1)、SpCas9-HF1、HypaCas9を用いた。その結果、改変型Cas9ではノックインの際に生じるNHEJ/MMEJ頻度も低下する傾向が認められた。また、ノックイン効率をピューロマイシン耐性の獲得頻度として評価したところ、改変型Cas9では、野生型Cas9よりも高い頻度で耐性を獲得し、ノックイン効率も向上することが明らかとなった。検討した3種類の改変型 Cas9のうち、数千塩基のDNA断片のノックインでもHypaCas9が最もNHEJ/MMEJ活性の抑制とHR活性の向上に有効であることが明らかとなった。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

HypaCas9が新たなCas9改変体として、一塩基置換だけでなく、ノックインにおいてもHR活性を高め、NHEJ/MMEJ活性の抑制に有効であることが明らかになった。また、これまでに得られた結果を論文として発表することができた(Kato-Inui, Nucleic Acids Research 2018) 。これらの改変は、生体内ゲノム編集に有用な小型のCas9であるSaCas9に有効であると予想されるため。

Strategy for Future Research Activity

これまでに得られた、HR頻度を向上させ、NHEJ/MMEJ頻度を抑制するためのアプローチを複合的にSaCas9に適用し、正確なゲノム編集を誘導可能な小型のSaCas9を作製し、生体内ゲノム編集に向けて準備を進める。また、ウィルソン病患者由来iPS細胞のATP7B遺伝子の変異の修正も、改良したCRISPR/Cas9のゲノム編集条件を駆使して実施する。

  • Research Products

    (8 results)

All 2019 2018 Other

All Journal Article (2 results) (of which Int'l Joint Research: 1 results,  Peer Reviewed: 2 results,  Open Access: 1 results) Presentation (3 results) (of which Int'l Joint Research: 1 results,  Invited: 1 results) Book (1 results) Remarks (2 results)

  • [Journal Article] Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 with improved proof-reading enhances homology-directed repair2018

    • Author(s)
      Kato-Inui Tomoko、Takahashi Gou、Hsu Szuyin、Miyaoka Yuichiro
    • Journal Title

      Nucleic Acids Research

      Volume: 46 Pages: 4677~4688

    • DOI

      10.1093/nar/gky264

    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] Detection and Quantification of HDR and NHEJ Induced by Genome Editing at Endogenous Gene Loci Using Droplet Digital PCR2018

    • Author(s)
      Miyaoka Yuichiro、Mayerl Steven J.、Chan Amanda H.、Conklin Bruce R.
    • Journal Title

      Methods in Molecular Biology

      Volume: 1768 Pages: 349~362

    • DOI

      10.1007/978-1-4939-7778-9_20

    • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
  • [Presentation] CRISPR/Cas9による相同組換え修復(HDR)を介した正確なゲノム編集を促進する条件の探索2018

    • Author(s)
      加藤-乾 朋子、高橋 剛、許 絲茵、宮岡 佑一郎
    • Organizer
      第91回 日本生化学会大会
    • Invited
  • [Presentation] Modified interactions between Cas9/Cas9 D10A nickase and genomic DNA enhances HDR2018

    • Author(s)
      Tomoko Kato, Gou Takahashi, Szuyin Hsu, Yuichiro Miyaoka
    • Organizer
      Cold Spring Harbor Laboratory, Genome Engineering: The CRISPR/Cas Revolution Meeting 2018
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] Cas9-DNA相互作用の改変によるゲノム編集の正確性向上は同時にHDR誘導活性も高める2018

    • Author(s)
      加藤-乾 朋子、高橋 剛、許 絲茵、宮岡 佑一郎
    • Organizer
      第3回 日本ゲノム編集学会年会
  • [Book] 今日からモノ知りシリーズ  トコトンやさしいゲノム編集の本2019

    • Author(s)
      宮岡 佑一郎
    • Total Pages
      160
    • Publisher
      日刊工業新聞社
    • ISBN
      4526079642
  • [Remarks] 公益財団法人 東京都医学総合研究所 再生医療プロジェクト 宮岡研究室

    • URL

      https://www.igakuken-regmed.com/

  • [Remarks] 未来を話そう! プロジェクト研究の紹介 再生医療プロジェクト

    • URL

      http://www.igakuken.or.jp/project/to-tomin/to-pro22.html

URL: 

Published: 2019-12-27  

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