2019 Fiscal Year Annual Research Report
遺伝子修復治療を可能にする正確なゲノム編集技術の開発
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17H04993
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| Research Institution | Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science |
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Principal Investigator |
宮岡 佑一郎 公益財団法人東京都医学総合研究所, 生体分子先端研究分野, プロジェクトリーダー (20549521)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | ゲノム編集 / HDR / NHEJ / Cas9改変体 / ノックイン / 相同組換え / 非相同末端結合 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
CRISPR/Cas9によるゲノム編集には、相同組換え (HR)、非相同性末端結合(NHEJ)、マイクロホモロジー媒介末端結合(MMEJ)などがある。HRは、正確で自在なゲノム編集を達成するために有益であるが、その頻度は NHEJやMMEJに比べて低い場合が多い。
前年度までに、HEK293T細胞を用いて、eSpCas9(1.1)、SpCas9-HF1、HypaCas9などの改変型Cas9がHR活性を亢進することを見出していた。今年度はさらに、HeLa細胞におけるHRによる一塩基置換の導入活性を検討し、HEK293T細胞の場合と同様に、改変型Cas9が通常のCas9に比べて高いHR活性を持つことが確認された。さらに、ヒトiPS細胞における約4.2 kbpのDNA断片のノックイン効率を、通常のCas9とHypaCas9とで比較したところ、HypaCas9が顕著に高いHR活性を示した。これらの結果から、HypaCas9を始めとする改変型Cas9による効率的なHR誘導が、細胞種を問わない一般的な特徴であることが示唆された。
改変型Cas9によるHR誘導活性をさらに高めるため、改変型Cas9と長さや配列を変化させたガイドRNAの組み合わせを検討したが、ほぼ全ての場合でゲノム編集活性自体が失われた。これは、改変型Cas9と改変したガイドRNAの組み合わせでは、Cas9-ガイドRNA複合体とDNAの相互作用が弱すぎるためと推測された。また、HR経路で機能するリコンビナーゼであるRAD51とCas9の融合タンパク質のHR活性も検討した。RAD51と通常のCas9またはCas9 D10A nicakseとの融合により、一部の遺伝子座でのみHR誘導活性の亢進が認められたが、RAD51との融合がHR誘導活性を向上させるという一般的な結論は得られなかった。
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| Research Progress Status |
令和元年度が最終年度であるため、記入しない。
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| Strategy for Future Research Activity |
令和元年度が最終年度であるため、記入しない。
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Research Products
(7 results)
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[Presentation] Genome-Edited iPSC and Pig Cardiomyopathy Models Reveal Mutant RBM20 Forms Mislocalized Granules to Dominantly Disrupt Global Splicing2019
Author(s)
Yuichiro Miyaoka, Kenneth Tan, Elena Matsa, Steven Mayerl, Amanda Chan, Vanessa Herrera, Aishwarya Kulkarni, Meenakshi Venkatasubramanian, Kashish Chetal, Han Sun, Francesca Briganti, Wu Wei, Saji Oommen, Daniel Carlson, Timothy Nelson, Lars Steinmetz, Jay Schneider, Bruce Conklin, Nathan Salomonis
Organizer
ISSCR 2019 Annual Meeting
Int'l Joint Research
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[Presentation] ゲノム編集iPS細胞およびブタを用いたスプライシング因子RBM20の変異による心筋症発症機序の解析2019
Author(s)
宮岡 佑一郎, Kenneth Tan, Elena Matsa, Steven Mayerl, Amanda Chan, Vanessa Herrera, Aishwarya Kulkarni, Meenakshi Venkatasubramanian, Kashish Chetal, Han Sun, Francesca Briganti Francesca, Wu Wei, Saji Oommen, Daniel Carlson, Timothy Nelson, Lars Steinmetz, Jay Schneider, Bruce Conklin, Nathan Salomonis
Organizer
第4回 日本ゲノム編集学会年会
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