2019 Fiscal Year Annual Research Report
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17H04995
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| Research Institution | University of Hyogo |
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Principal Investigator |
町田 幸大 兵庫県立大学, 工学研究科, 助教 (20553093)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | バイオテクノロジー / 脳神経疾患 / 生体分子 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本年度は、CAGリピートのrepeat-associated non-ATG 翻訳（RAN翻訳）について、翻訳産物として得られるポリグルタミン：polyQ、ポリセリン：polyS、ポリアラニン：polyAのそれぞれの合成割合と凝集性を3種類のタグ（ポリグルタミンならばMYCタグ、ポリセリンならばFLAGタグ、ポリアラニンならばHAタグ）を利用して区別するためのPlasmidを構築し、293T細胞とHeLa細胞由来無細胞タンパク質合成系で解析するための実験を進めてきた。その結果、293T細胞ではポリグルタミン＜ポリセリン＜ポリアラニンの順に凝集性が高いことが明らかになった。一方、HeLa細胞由来無細胞タンパク質合成系でも同様の結果が得られたが、ポリセリンの凝集性については293T細胞よりも大幅に緩和されていた。HeLa細胞由来無細胞タンパク質合成系は細胞膜を含まない合成システムなので、ポリセリンは細胞内では、細胞膜と相互作用して凝集性が高くなっていることが示唆された。さらに、遺伝子上のどの位置からRNA翻訳が開始するかを探る手掛かりとするために、通常の開始コドンを抜いたPlasmidを構築し、±開始コドンで合成量を比較したところ、＋開始コドンと比較して、-開始コドンでは、ポリグルタミンの合成量は低下し合成産物の分子量がわずかに小さくなった。ポリセリンの場合は分子量に変化はなかったが、凝集性が増した。また、ポリアラニンの場合は分子量にも凝集性にも変化がなかった。以上より、ポリグルタミンのほとんどは既存の位置の開始コドンに依存した翻訳により合成が行われているが、ポリセリンやポリアラニンは先行研究の通り、既存の開始コドンよりも下流からのRAN翻訳により合成されていることが我々の合成系でも再現できた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
研究の進捗に関しては、疾患に関連する細胞内現象の一部を、我々が構築した無細胞タンパク質合成系（試験管内タンパク質合成系）で再現することに成功しており、細胞内反応をin vitroで迅速に再現・解析するためのシステム構築を行えている。また、本研究のベースとなる再構成型タンパク質合成系の維持に必要な構成因子群の供給（翻訳関連因子群の調製）に関しても、前年度に引き続き、個々の因子の発現方法や精製方法における問題点について、研究室に配属される学部生や大学院生と協力しながら、ファインチューニングを進めて、より良い研究ツールへの発展を試みている。
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| Strategy for Future Research Activity |
発現Plasmidの開始コドンを終始コドンへ変更、特定の配列の前後に終始コドンを導入、またはそれらを組み合わせることで、予め遺伝子上で翻訳を制御しておいて、その制御に翻訳産物が合致するかを、無細胞タンパク質合成系を利用して解析する。これによりCAGリピートのrepeat-associated non-ATG 翻訳（RAN翻訳）の機構の解明を目指す。
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[Journal Article] HCV IRES Captures an Actively Translating 80S Ribosome.2019
Author(s)
Yokoyama T, Machida K, Iwasaki W, Shigeta T, Nishimoto M, Takahashi M, Sakamoto A, Yonemochi M, Harada Y, Shigematsu H, Shirouzu M, Tadakuma H, Imataka H, Ito T.
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Journal Title
Molecular Cell
Volume: 74
Pages: 1205-1214
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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