Pre-tRNA cappingが関与する遺伝子発現制御機構の探究

2017 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 17H04997
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 大平 高之 東京大学, 大学院工学系研究科(工学部), 助教 (90727520)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: tRNA / 成熟化 / 5' cap / 転写後修飾 / 遺伝子発現制御

Outline of Annual Research Achievements

平成29年度は、以下の２つの課題を実施した。
①5’cap修飾を持つpre-tRNAの特定と動態の解析：5’cap修飾されたpre-tRNAを網羅的かつ高感度に特定するため、CAGE法を利用した5’cap修飾されたtRNAの精製法を確立した後、得られた精製物をハイスループットシークエンサーにより網羅的に解析することを予定していたが、サンプルの回収量が少ないなど問題が生じたため、精製方法およびcDNAライブラリの調製方法など実験系全体を見直し、新たなサンプル調製の方法や条件検討を追加した。具体的には、5’cap修飾されたpre-tRNAの調製には抗メチル化グアノシンキャップ抗体を使用した。また、cDNAライブラリの調製には脱メチル化酵素処理の追加やライゲーション反応や逆転写反応に用いる酵素を変更することで実験系を改善した。
②pre-tRNA cappingが関与する新規の遺伝子発現制御機構の探求：5’cap修飾されたpre-tRNAとキャップ修飾依存的に結合するタンパク質が存在しているかどうかを検証するため、相互作用することが期待される複数のタンパク質について、アフィニティータグを融合した発現株を構築し、これら株から調製した細胞抽出液についてアフィニティー精製を行い、得られた精製画分からRNAを調製した後、ノーザンブロットによりpre-tRNAとの相互作用の有無を調べた。その結果、5’cap修飾されたpre-tRNAとキャップ修飾依存的に相互作用するタンパク質が特定された。さらに、pre-tRNAにアフィニティー精製用のRNAアプタマーを挿入した改変株を構築し、細胞抽出液から改変pre-tRNAをアフィニティー精製した後、ペプチドマス解析により5’cap修飾依存的に結合しているタンパク質を網羅的に調べたところ、上述のタンパク質と相互作用していることが確認された。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

①については目的としていた実験手法の確立が未だ達成できておらず現在継続中である。この関係で計画していた5’ cap 修飾されたpre-tRNAの細胞内局在や定量的な解析など他の実験を実施出来ておらず計画に遅れが出ている。②についてはおおむね順調に進展していると考えている。

Strategy for Future Research Activity

研究計画と比べて進捗に遅れがあるが、条件検討を慎重に行いながら研究を進める。研究内容には問題がないと考えているので内容は変更せず計画通り研究を進める予定である。