2017 Fiscal Year Annual Research Report
Structural study for ligand recognition in G-protein coupled receptors
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17H05000
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
西澤 知宏 東京大学, 大学院理学系研究科(理学部), 助教 (80599077)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | GPCR / X線結晶構造解析 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
非ペプチド性アンタゴニスト結合型ETB 受容体の構造解析を行った。臨床薬として用いられているボセンタンなど，非ペプチド性アンタゴニストと受容体の相互作用を明らかにするため，複合体結晶構造解析を行った．ボセンタンを含む複数の非ペプチド性薬剤とETB 受容体の複合体の結晶化を得ることに成功したが，10-20 μmと非常にサイズが小さかったため，単一の結晶からデータ収集を行うことが困難であった．そこで，薬剤との複合体の結晶約１００個程度からそれぞれ５-10 度ずつの回折データ収集を行い，それらのデータをマージすることで構造解析を行った．過去に報告したエンドセリン-1結合型の結晶構造を用いて分子置換法を行い，ボセンタンおよびその誘導体であるK-8793の結合した結晶構造の決定に成功した．ボセンタン骨格を持つ薬剤はいずれもがスルフォアミドの負電荷が受容体側の正荷電性アミノ酸によって認識され，周囲の疎水性置換基が結合ポケットを埋めるようにして受容体側のアミノ酸と相互作用していた．
興味深いことに，この相互作用はアゴニストであるペプチド性リガンドのエンドセリン-1に対する相互作用の一部を模しており，ペプチド性アゴニストと小分子アンタゴニストにおける予想外の類似性を見出すこととなった．一方で，小分子アンタゴニストでは活性化に直接関わると考えられる6番目の膜貫通ヘリックスの内側への動きを阻害するように置換基が配置されており，受容体の活性化を抑えるための性質がうまく説明できるものであった．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
当初予定されていた非ペプチド性アンタゴニスト結合型ETB 受容体の構造解析では臨床薬として用いられているボセンタンだけでなく，その誘導体のK-8794の構造解析にも成功し，アンタゴニストの機構解明にとどまらず受容体のサブタイプ選択性に関しても一定の知見を得ることに成功した．さらにK-8794結合型の結晶構造は2.2 Åという非常に高分解能で行うことができたため，GPCRにおいて保存されたNa+結合サイトにおける詳細の水素結合ネットワークにおける変化を含めた受容体活性化機構の解明に至った．これらの結果は，エンドセリン受容体は他のclassA GPCRとは少し異なる活性化機構を持つことを示唆しており，新規の知見を得るに至った．さらに，非ペプチド性アンタゴニストと受容体の相互作用は，アゴニストであるペプチド性リガンドのエンドセリン-1に対する相互作用の一部を模しており，ペプチド性アゴニストと小分子アンタゴニストにおける予想外の類似性を示していた．これらの結果は論文としてまとめてNature Structural and Molecular Biologyに掲載された．
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| Strategy for Future Research Activity |
ETB，ETA受容体は異なるペプチド異性体に対して異なる選択性を示す．このサブタイプ選択性の分子基盤を明らかにするために，複数のペプチド異性体と受容体との複合体結晶構造解析を行う．過去の結晶構造解析と同様に，熱安定性を向上させたETB受容体のコンストラクトを用いて，ETB受容体に対する特異性の高いエンドセリン-3 との複合体の構造解析を行う．予備的な結晶は既に得られており，結晶化条件の検討を行うことで結晶のサイズなどを向上させ，構造解析を行う．さらにETA 受容体とエンドセリン-1 との複合体の構造解析を行い，これらの構造を比較することによってサブタイプ間の違いを明らかにする．野生型のETA 受容体で結晶が得られない場合は，ETB 受容体で熱安定を向上させた変異と同じ部位に変異を導入することで，熱安定化ETA 受容体コンストラクトを作製して結晶化を行う．
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Research Products
(6 results)
