2019 Fiscal Year Annual Research Report
複雑な分子間反応の連鎖を光操作で解き明かすーアポトーシス機構の分子論的理解ー
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17H05001
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
中曽根 祐介 京都大学, 理学研究科, 助教 (00613019)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 細胞死 / 光操作 / Caspase / 光センサー / 分子間反応 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
アポトーシス機構の分子論的理解を目的とし、関連因子の活性を効率的に光制御する系の構築を試みた。前年度まで、アポトーシス実行因子であるCaspase7を対象に、青色センサーLOVドメインの構造変化を利用した分子設計を多数試みたが、暗状態・明状態を問わず高い活性を持ち、これを発現させた細胞は光照射の有無にかかわらず高い確率で細胞死が誘導されることがわかった。そのため新しい操作素子として光でペプチド鎖が開裂し、二分子に解離する人工蛋白質（PhoCl)を取り上げたが、ペプチドの開裂後、二分子への解離反応は非常に遅いことがわかった（約１時間）。また開裂反応の量子収率が極めて低いことも明らかとなり、効率的な光制御に不向きであることがわかった。
そこで本年度は光操作する対象をCaspase7からCaspase8に切り替えた。Caspase8はアポトーシス開始因子であり、Caspase7の上流に位置する。その活性は会合反応に伴う自己切断により上昇することも知られている。またCaspase8による細胞死シグナルは細胞内で効率的に増幅されるため、これを光操作できれば確実に細胞死を誘導可能な応用性の高いツールとなる。
ただしCaspase一般に大腸菌内で大量発現すると自己活性化してしまい、不活性状態での回収が困難であった。しかし、Caspase8は特定の条件下で封入体に移行し、ここから回収すると不活性状態で回収できる。既に不活性状態のタンパク質の精製に成功しており、薬剤添加によりダイマー化を誘導した場合、自己切断を起こすと伴に酵素活性が顕著に上昇することがわかった。現在は光依存的に会合反応を起こすタンパク質を光操作素子として用いた分子設計を行っている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
前年度まで二つの光操作素子をテストしたが、細胞死の効率的な誘導は達成できなかった。今年度は新しい対象に切り替え、不活性状態のタンパク質試料の回収に成功したが、光依存的に細胞死を誘導する系の確立には至っていないため。
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| Strategy for Future Research Activity |
本年度は光操作素子として会合反応を起こすタンパク質をCaspase8に遺伝学的に付加し、その活性制御を実現する。光操作素子としてVVD, Crphot-LOV1, Cryptochromeを試行し、また接続する際のリンカー長を調節することで効率的かつ可逆的な活性のON/OFFを実現する。細胞を用いた実験により細胞死の効率的な誘導が実現でき次第、その分子機構の解明に取り組む。アポトーシス反応を光駆動できる点を利用して、レーザー分光法を用いて、高時間分解でCaspase8の活性化や下流分子との相互作用、切断過程を検出する。こうしてアポトーシス機構の分子論的・速度論的理解を達成する。
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