2017 Fiscal Year Annual Research Report
透過性細胞を用いた複製および転写におけるクロマチンダイナミクスの解析
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17H05013
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| Research Institution | Japanese Foundation for Cancer Research |
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Principal Investigator |
立和名 博昭 公益財団法人がん研究会, がん研究所 がん生物部, 研究員 (70546382)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | ヒストン / クロマチン / エピジェネティクス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ヒストンタンパク質の取り込みを生化学的に解析するために、以下の実験系の確立を行なった。
まず、培養細胞を界面活性剤にて処理した透過性細胞および試験管内再構成したヒストン複合体を準備した。透過性細胞は細胞膜および核膜に孔があいているため、タンパク質のような高分子を外から加えることが可能である。多くの可溶性タンパク質は除かれるが、不溶性のクロマチンは透過性細胞中に残っている。そのため、加えた因子はクロマチンに反応する。本研究は、透過性細胞にヒストン複合体を細胞抽出液とともに添加し、透過性細胞中のクロマチンにヒストン複合体を取り込ませることで、ヒストンの取り込み機構の解析を行う。試験管内再構成したヒストン複合体にはエピトープタグを付加しているため、エピトープタグによる抗体により検出および回収することが可能である。本実験系の有効性をH3.1-H4複合体およびH3.3-H4複合体を用いて確認を行なった。H3.1-H4複合体は複製依存的にクロマチンに取り込まれ、H3.3-H4複合体は複製非依存的にクロマチンに取り込まれる。免疫染色法およびクロマチン免疫沈降法により確認したところ、本実験系においても上記の取り込み機構は再現されていることが確認できた。本実験系をRhIP(Reconstituted histone complex incorporation into chromatin of Permeabilized cells)アッセイと呼ぶこととした。そこで、明らかとなっていなかったH2A-H2B、H2A.X-H2BおよびH2A.Z-H2B複合体のクロマチンへの取り込み機構を本実験系により解析を行うことにした。これらの因子を試験管内において再構成することに成功し、解析を進めているところである。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
現在までにRhIPアッセイの有効性の確認ができ、ヒストンの取り込みを解析する上で非常に有効であることを示すことができた。RhIPアッセイに免疫染色法を組み合わせたRhIP-immunostaining、クロマチン免疫沈降を組み合わせたRhIP-ChIPおよびRhIP-ChIP-seqの手法も一般化することに成功した。さらに、定量的にChIP-seqデータを解析するために、ライブラリーに分子バーコードを付加する方法の確立も行なった。
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| Strategy for Future Research Activity |
RhIPアッセイをもとに、クロマチン構造とヒストンの取り込みの関係性を明らかにする。特にRhIP-ChIP-seqにより、DNA配列レベルでのヒストンの取り込みの解析を行う。また、複製に依存した取り込み機構と依存しない取り込み機構を解析するためにS期に同調した細胞を準備し、RhIPアッセイを行う。
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