2019 Fiscal Year Annual Research Report
鱗翅目幼虫中腸における栄養・解毒の複合系代謝制御機構の解明
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17H05029
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
吉永 直子 京都大学, 農学研究科, 助教 (40456819)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | SiRNAi / ゲノム編集 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
鱗翅目幼虫ハスモンヨトウは、非寄主植物であるクチナシ葉を摂食させた際にクチナシ葉中のイリドイドを解毒するためにβ-alanineを多量に腸管内に誘導する。この際にイリドイドのアグリコンと遊離した糖の双方に応答してβ-alanine誘導メカニズムが起動することを定量的に突き止め、この一連の研究成果について投稿論文を執筆した。さらに、同様の解毒メカニズムが寄主植物であるキャベツを摂食した際にも誘起されることを明らかにし、そのメカニズム解明を進めた。キャベツ中にはイリドイドが報告されておらず、別の低分子化合物がβ-alanine誘導のエリシターと考えられる。その活性低分子がキャベツ抽出物中の水溶性画分に含まれることを突き止めた。一方、ハスモンヨトウと同じ広食性鱗翅目幼虫であるオオタバコガではクチナシ及びキャベツのいずれを摂食させた場合も、このような解毒機構を持たないことが明らかになった。オオタバコガではクチナシを摂食後も支障なく蛹化したことから、ハスモンヨトウとは異なる解毒機構を持つ可能性が示唆された。
一方、広食性ハスモンヨトウの窒素代謝促進化合物であるFACsの生合成酵素同定も進めた。残念ながら昆虫細胞を用いたSiRNAiでは活性確認できなかったため、ゲノム編集でのノックダウン系統作出へと方向転換した。ハスモンヨトウ虫体を用いたCRISPR/Cas9はまだ例がなく、独自の実験系の立ち上げを行った。最も難関であった卵塊への注入は予備試験的ではあるが一定の成功率を達成した。目的酵素遺伝子ノックアウト系統作出に必須となるステップをクリアすることができた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
昆虫細胞Sf900を用いたSiRNAiで、昆虫細胞におけるFACs生合成能を確認し、これをノックダウンする方向で進めた。しかしながら昆虫細胞を用いたRNAiは安定性に乏しく、明瞭なノックダウンを示す結果が得られなかった。また、再三の昆虫細胞購入による更新を経てもFACsの生合成能自体が確認できないなどの支障が出たため、この実験を中止し、ゲノム編集に切り替えることとした。
その一方で、体内各部位におけるFACs生合成候補遺伝子の発現量を評価したところ、虫体におけるFACsの生合成量及び蓄積量と矛盾しない結果となった。すなわち、腸管周辺と脂肪体において活性があること、表皮や体液、マルピーギ管などでは活性がない点で一致した。当該酵素がFACs生合成酵素の候補として妥当であることの傍証となった。
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| Strategy for Future Research Activity |
ハスモンヨトウにおけるゲノム編集を最優先に行い、候補遺伝子ノックアウト系統の作出並びにFACsの生理機能解明を進める。
また、ハスモンヨトウの解毒代謝に関しては、β-alanine誘導に関わる遺伝子を突き止めるため、候補となる生合成経路に関する遺伝子の発現量を定量的に評価する。この解毒に関わるアミノ酸代謝経路を明らかにすることで、FACs生合成能をノックアウトした系統において窒素代謝に何らかの瑕疵が生じている場合に、解毒能力にどれほど支障が出るかを明らかにする。
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Research Products
(4 results)
