Elucidation of molecular mechanisms of chemotherapy resistance based on interactions between tumor cells and tumor microenvironment

2017 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 17H05043
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 富安 博隆 東京大学, 大学院農学生命科学研究科(農学部), 助教 (70776111)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: エクソソーム / 化学療法耐性 / miRNA / 腫瘍微小環境 / 腫瘍免疫

Outline of Annual Research Achievements

本研究は、犬のリンパ系腫瘍に関して、細胞外小胞の一つであるエクソソームを介した腫瘍細胞と免疫細胞の相互作用という新たな観点からその病態を解析し、特に化学療法耐性獲得の分子機構を解明することを目指している。
本年度はまず４つのリンパ系腫瘍細胞由来のエクソソームが含有する分子プロファイルの網羅的解析および細胞株間での比較を行った。
まずmiRNAに関しては、エクソソームに特に多く含有されるmiRNAは４細胞株においてそのほとんどが共通していた。しかしながらmiRNA含有プロファイル全体を比較した場合、エクソソームに含有されるmiRNAのプロファイルは、由来する親細胞のプロファイルに類似しており各細胞株間で違いが認められた。特に薬剤感受性株由来のエクソソームと薬剤耐性株由来のエクソソームに含まれるmiRNAの含有量を比較した際に、これらの間で有意に含有量が異なる複数種のmiRNAが抽出された。これらのmiRNAは、腫瘍細胞の増殖などに関与する細胞内シグナルに関わるタンパク質の発現を制御するとされており、今後その生物学的機能と薬剤感受性との関連の解明を行う予定である。
次にエクソソームに含有されるタンパク質に関しても解析した結果、やはり特に多く含有されるタンパク質は４細胞株においてほとんどが共通しており、細胞骨格に関わるタンパク質などが含まれていた。しかしながら、薬材感受性株由来のエクソソームと薬剤耐性株由来のエクソソームでは含有量が明らかに異なるタンパク質が同定された。このタンパク質は腫瘍細胞の転移などその挙動に関与することが明らかとなってきている分子であり、このタンパク質に関しても今後その生物学的機能と薬剤感受性との関連を詳細に検討する予定である。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

上記のように、本年度実施した４つのリンパ系腫瘍細胞由来のエクソソームが含有する分子プロファイルの網羅的解析および細胞株間での比較によって薬剤感受性株および耐性株の間で含有量が明らかに異なるmiRNAおよびタンパク質が同定された。これらの分子は腫瘍細胞の増殖や転移に関与することが近年示唆され始めている分子であるものの、これまでに人医学および獣医学領域の双方において薬剤感受性との関連は詳細に検討されてきておらず、その生物学的機能の解明を行うことでさらに新たな知見が得られる可能性が高い。これらの知見はエクソソームの分子プロファイルという新たな観点から化学療法耐性に関する研究を遂行した成果と言える。現在この研究成果を学術論文として公表する準備を進めるとともに、すでにその生物学的機能の解明のための研究に着手している。

Strategy for Future Research Activity

次年度は以下の3つの研究計画を実施する予定であり、特にエクソソームが免疫細胞や腫瘍細胞に与える影響に関して詳細に
検討する計画である。
まずは本年度に実施した、エクソソームに含まれる分子プロファイルの網羅的な解析結果に基づき、薬剤感受性腫瘍細胞と薬剤耐性腫瘍細胞の間でエクソソーム中の含有量が有意に異なっていたmiRNAおよびタンパク質の生物学的機能の探索を行う。
次にリンパ系腫瘍細胞株由来エクソソームが免疫細胞に与える影響の検討とその責任分子の同定を行う。この目的のために健常犬から分離・活性化させたリンパ球・マクロファージに対し犬のリンパ系腫瘍細胞株から回収したエクソソームを添加し、RNAシーケンシングを用いて遺伝子発現プロファイルを解析しその変化を検討する。また、同様に分離・活性化したリンパ球およびマクロファージにリンパ系腫瘍細胞株由来エクソソームを添加した後、培養上清中の各種サイトカインを定量するとともに、細胞周期分布の解析やマクロファージの貪食能を解析しその変化を検討する。これらの研究の結果から、エクソソーム添加による免疫細胞の遺伝子発現プロファイルや表現型の変化において重要な細胞内シグナル経路を探索しエクソソーム側の責任分子を推定する。
また、免疫細胞株由来エクソソームが腫瘍細胞に与える影響の検討とその責任分子の同定も行う。この目的のために健常犬から採血を行い、制御性T細胞の分離および単球のマクロファージへの分化誘導を行う。これらの細胞の培養上清から回収したエクソソームを犬のリンパ系腫瘍細胞株に添加した後、RNAシーケンシングを用いて遺伝子発現プロファイルを解析しその変化を検討する。

Research Products

• [Int'l Joint Research] University of California, Davis(米国)
  • Country Name: U.S.A.
  • Counterpart Institution: University of California, Davis
• [Journal Article] Comprehensive analysis of gene expression profiles reveals novel candidates of chemotherapy resistant factors in canine lymphoma (2017)
  • Author(s): Suenaga, M., Tomiyasu, H., Watanabe, M., Ogawa, K., Motegi, T., Goto-Koshino, Y., Ohno, K., Sugano, S., Skorupski, K.A. and Tsujimoto, H.
  • Journal Title: The Veterinary Journal Volume: 228 Pages: 18～21
  • DOI: 10.1016/j.tvjl.2017.10.002
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] A 2-base insertion in exon 5 is a common mutation of the TP53 gene in dogs with histiocytic sarcoma (2017)
  • Author(s): Asada, H., Tsuboi, M., Chambers, J.K., Uchida K., Tomiyasu, H., Goto-Koshino, Y., Ohno, K. and Tsujimoto, H.
  • Journal Title: Journal of Veterinary Medical Science Volume: 79 Pages: 1721～1726
  • DOI: 10.1292/jvms.17-0197
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Significance of clonal rearrangements of lymphocyte antigen receptor genes on the prognosis of chronic enteropathy in 22 Shiba dogs (2017)
  • Author(s): Ohmi, A., Ohno, K., Uchida, K., Goto-Koshino, Y., Tomiyasu, H., Kanemoto, H., Fikushima, K. and Tsujimoto, H.
  • Journal Title: Journal of Veterinary Medical Science Volume: 79 Pages: 1578～1584
  • DOI: 10.1292/jvms.16-0626
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] イヌDLBCLにおけるゲノムワイドDNAメチル化パターンと予後との関連 (2018)
  • Author(s): 久本真也、山崎淳平、茂木朋貴、富安博隆、後藤（越野）裕子、辻本元、稲葉睦
  • Organizer: 第14回日本獣医内科学アカデミー学術大会
• [Presentation] ジャックラッセルテリアにおける消化管腺癌の臨床的特徴と予後 (2018)
  • Author(s): 大参亜紀、大野耕一、横山望、中川泰輔、富安博隆、チェンバーズ・ジェームズ、内田和幸、辻本元
  • Organizer: 第14回日本獣医内科学アカデミー学術大会
• [Presentation] A 2-Base Insertion Mutation of TP53 Gene and its Intratumor Heterogeneity in Canine Histiocytic Sarcoma (2017)
  • Author(s): Asada Hajime, Ichii Osamu, Tomiyasu Hirotaka, Tsuboi Masaya, Uchida Kazuyuki, Goto-Koshino Yuko, Ohno Koichi, Kon Yasuhiro, Tsujimoto Hajime
  • Organizer: Veterinary Cancer Society Annual Conference 2017
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] A Gene Expression Scoring System to Predict Chemotherapy Resistance Using Novel Drug Resistance Factors in Canine Lymphoma (2017)
  • Author(s): Ogawa Kotoko, Tomiyasu Hirotaka, Suenaga Miyu, Watanabe Manabu, Sugano Sumio, Motegi Tomoki, Takeuchi Yoshinori, Omi Aki, Goto-Koshino Yuko, Ohno Koichi, Skorupski Katherine, Tsujimoto Hajime
  • Organizer: Veterinary Cancer Society Annual Conference 2017
  • Int'l Joint Research