2018 Fiscal Year Annual Research Report
In vivoゲノム編集による肝疾患治療の実現を目指した脂質ナノ粒子の創生
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17H05052
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
佐藤 悠介 北海道大学, 薬学研究院, 助教 (10735624)
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2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | RNP送達 / 脂質ナノ粒子 / pH感受性カチオン性脂質 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
初年度に開発した、高分子薬物の細胞質送達の要であるpH感受性カチオン性脂質ライブラリに関するPCT出願および学術論文発表を行った。
ゲノム編集酵素であるCas9-gRNA複合体（RNP）を搭載した脂質ナノ粒子（RNP-LNP）を製造するための諸条件の検討を行った。RNP-LNPの製造は、高い再現性とシームレスなスケールアップ製造が可能なマイクロ流路を用い、アルコール希釈法を原理として行った。マイクロ流路に通した後のRNPによる標的二本鎖DNAの切断活性を指標に評価した結果、RNPの活性を損なわない製造条件を見出すことに成功した。
続いて、上述のpH感受性カチオン性脂質ライブラリを基盤として、RNP-LNPの処方最適化を行った。RNP送達に適した製剤処方に関する情報は非常に乏しく、重要な因子が明らかではない一方で、LNPの製剤処方は用いる脂質の種類とその組合せ方、更にはそれらの含量比等、LNPの物性や薬物送達効率に影響を与える因子が複雑である。そこで、実験計画法を活用することで迅速かつ合理的な処方最適化を行った。2段階のスクリーニングにより、LNPの粒子径、RNP搭載効率、遺伝子ノックアウト（KO）活性に影響を与える因子の同定と共に、優れたKO活性（50%有効濃度として0.1 nM RNP以下）を示すLNPの製造条件を見出すことに成功した。また、0.5 nM RNP以上の添加濃度において、KO効率100%を達成した。遺伝子KOを誘導するのに必要な細胞への添加濃度は競合技術（RNP送達用人工ナノ粒子製剤）と比較して100倍以上低かった。さらに、一本鎖DNAを細胞へ共導入することでゲノムの塩基置換に成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
RNP-LNPの製剤処方の最適化の結果、研究実績の概要に記載の通り、競合技術と比較して100倍以上効率的にRNPを細胞へ送達可能な製剤の開発に成功した。本成果は計画当初の目標を大幅に超える成果であり、特許出願を進めている段階である。In vivoにおける検討に関してはやや遅れているが、上述の優れた遺伝子ノックアウト活性に加え、細胞系における一本鎖DNAの共導入による塩基置換やin vivo応用に必要なLNPの物性制御は既に達成されている。また、in vivo実験に用いるgRNAの選定や評価系の構築は既に終了し、遺伝子ノックイン（KI)用のDNAの調製にも既に進めており、重要な要素技術はほぼ確立することに成功している。
以上より、当初の計画以上に進展していると考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
In vitroにおける検討で得られた製剤処方に関する知見を基に、in vivo肝臓におけるRNP-LNP最適化を進める。遺伝子KOのみならず、塩基置換や遺伝子KIを実現可能な製剤の開発を行う。今年度において、期待を上回る遺伝子KO活性を示す製剤を見出したことから、肝臓のみならず、他の細胞（免疫細胞や骨格筋細胞など）を標的とした製剤を並行して開発することで多様な疾患へ応用可能な技術を構築する。
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