2017 Fiscal Year Annual Research Report
がんにおける薬剤耐性の阻害を目指したZIC5標的薬の同定と検証
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17H05056
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| Research Institution | Tokyo University of Pharmacy and Life Science |
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Principal Investigator |
佐藤 礼子 東京薬科大学, 生命科学部, 助教 (90469966)
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2017-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 薬剤耐性 / ZIC5 / スクリーニング |
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| Outline of Annual Research Achievements |
がん細胞が治療薬に抵抗性を持つ現象である「薬剤耐性」はがん根治を妨げる大きな問題であり、薬剤耐性を克服する治療法の開発が必要である。申請者はこれまでに、メラノーマの薬剤耐性を促進させている遺伝子としてZIC5を同定している。がん特異的に高発現しているZIC5がSTAT3とFAKを活性化し、メラノーマ・大腸癌・前立腺癌の薬剤耐性を亢進させていることを明らかにした。ZIC5を阻害すると、分子標的薬や抗がん剤による細胞死の誘導率が大幅に増加する。また、ZIC5の阻害により、既に薬剤耐性を獲得しているメラノーマ細胞の細胞死も誘導できる。ZIC5は、ヒト正常組織における発現が少ない為、薬剤耐性を減弱させる為の優れた標的分子になると考えられる。本研究の目的は、ZIC5の機能を阻害する低分子化合物を見つけ出し、ZIC5阻害薬が薬剤耐性の減弱に有効であることを示すことである。
当該年度は、「ZIC5の核内存在量を低下させる低分子化合物の同定」を進めた。まず、GFP融合ZIC5を作製し、GFP-ZIC5がメラノーマ細胞株A375細胞の核に局在することを確認した。この細胞を使用し、スクリーニングの系を決定した。In Cell Analyzer 2000 (GE healthcare) を使用し、核や細胞質におけるGFP量を定量し、正しく核/細胞質における局在を定量できることを確認した。東京大学創薬機構から低分子化合物ライブラリーを入手し、一次スクリーニングを行った。現在までに、３３９６化合物の一次スクリーニングが終了し、３７コのヒット化合物を得ている。さらに、これらの化合物について、2次スクリーニングを行っている。また、酵母two-hybrid 法により約１０コのZIC5結合候補タンパク質を同定した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
「ZIC5の核内存在量を低下させる低分子化合物の同定」を進めた。まず、GFP融合ZIC5を作製し、GFP-ZIC5がメラノーマ細胞株A375細胞の核内に局在することを確認した。この細胞を使用し、スクリーニングの系を決定した。In Cell Analyzer 2000 (GE healthcare) を使用し、核や細胞質におけるGFP量を定量し、正しく核/細胞質における局在を定量できることを確認した。東京大学創薬機構から低分子化合物ライブラリーを入手し、一次スクリーニングを行った。現在までに、３３９６化合物の一次スクリーニングが終了し、３７コのヒット化合物を得ている。さらに、2次スクリーニングとして、これらの化合物が、タグなしのZIC5の核局在やタンパク量を減少させるか、化合物とBRAF阻害薬との併用で相乗的にメラノーマ細胞に細胞死を引き起こすか、正常ヒトメラノサイトの生存に影響を与えないか、を検証している。
また、「ZIC5調節分子をターゲットとする低分子化合物の同定」の為、ZIC5結合タンパク質のスクリーニングを行った。酵母two-hybrid 法は従来の方法より特異性が高いことが示されているMachmaker Gold Yeast Two-Hybrid System (Clontech)を用いて行った。ZIC5をbaitとし、prey側は市販されているNormalized human universal cDNA library (Clontech)を用いて行い、現在までに約10個の候補タンパク質が同定されている。
以上の結果は、特にスクリーニングにおいて既に2次スクリーニングに進んでいる化合物が複数存在し、計画以上に進展していると考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
「ZIC5の核内存在量を低下させる低分子化合物の同定」においては、これまでに得られているヒット化合物３７コについて2次スクリーニングを行い、候補化合物を絞り込む。さらに、候補化合物による細胞死誘導がZIC5の抑制を介しているかを検証する。ZIC5の抑制による細胞死誘導効果が確認された低分子化合物については、試験するがん細胞・正常細胞の種類を拡大する。正常細胞における毒性が低く、多くのがん細胞に有効であることが確認できた化合物に対しては、最終的にマウスを用いたin vivoの実験系における効果を検証する。これらの検証の結果、有効な化合物が得られなかった場合、さらに多くの低分子化合物ライブラリについて一次スクリーニングを行う。
また、「ZIC5調節分子をターゲットとする低分子化合物の同定」において、これまでに同定したZIC5結合候補タンパク質について、免疫沈降法などでZIC5との結合の有無を確認する。ZIC5と結合する事が確認できたタンパク質の中から、ZIC5の薬剤耐性促進能に重要なタンパク質を同定する。ZIC5高発現細胞であるA375細胞においてZIC5結合タンパク質をRNAi法にて発現抑制し、BRAF阻害剤による細胞死誘導率が増大するか検証する。この実験により、薬剤耐性に関与しているZIC5結合因子が同定できる。さらに、ZIC5過剰発現系において、ZIC5結合タンパク質を発現抑制し、ZIC5による薬剤耐性の亢進を抑制できるタンパク質を同定する。
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