2018 Fiscal Year Annual Research Report
がんにおける薬剤耐性の阻害を目指したZIC5標的薬の同定と検証
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17H05056
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| Research Institution | Tokyo University of Pharmacy and Life Science |
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Principal Investigator |
佐藤 礼子 東京薬科大学, 生命科学部, 助教 (90469966)
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2017-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | ZIC5 / 創薬スクリーニング |
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| Outline of Annual Research Achievements |
がん細胞が治療薬に抵抗性を持つ現象である「薬剤耐性」はがん根治を妨げる大きな問題であり、薬剤耐性を克服する治療法の開発が必要である。申請者はこれまでに、メラノーマの薬剤耐性を亢進させている因子としてZIC5を同定している。がん特異的に高発現しているZIC5がSTAT3とFAKを活性化し、メラノーマ・大腸癌・前立腺癌の薬剤耐性を亢進させていることを明らかにしている。ZIC5を阻害すると、分子標的薬や抗がん剤によるがん細胞死の誘導率が大幅に増加する。また、ZIC5の阻害により、既に薬剤耐性を獲得しているメラノーマ細胞の細胞死も誘導できる。ZIC5はヒト正常組織における発現が少ない為、がん治療における薬剤耐性を減弱させる為の優れた標的分子になると考えられる。本研究の目的は、ZIC5の機能を阻害する低分子化合物を見つけ出し、ZIC5阻害薬が薬剤耐性の減弱に有効であることを示すことである。
これまでに、３３９６化合物の一次スクリーニングが終了し、37コのヒット化合物を得ている。これら37コのヒット化合物に対して二次スクリーニングを行い、これらの中からZIC5の局在やタンパク量を変化させる化合物を選抜した。また、正常ヒトメラノサイトに対する影響や複数のメラノーマ細胞株に対して細胞死誘導効果を検証した。
また、酵母two-hybrid 法により約１０コのZIC5結合候補タンパク質を同定しているが、それらをクローニングし、メラノーマ細胞内でのZIC5との結合を免疫沈降法で検証した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
「ZIC5の核内存在量を低下させる低分子化合物の同定」を進めた。これまでに、GFP融合ZIC5を使用したスクリーニング系を構築し、３３９６化合物の一次スクリーニングを行い、３７コのヒット化合物を得ている。2次スクリーニングにおいては、タグなしのZIC5を過剰発現させたメラノーマ細胞株を使用し、ヒット化合物を添加後、細胞を固定し、ZIC5の免疫染色を行い、ZIC5のタンパク量や局在に変化を及ぼす化合物を同定した。さらに、これらの化合物が正常ヒトメラノサイトに細胞死を誘導するか、様々なメラノーマ細胞株に対して細胞死を誘導するかを検証した。その結果、2つの化合物は正常ヒトメラノサイトやZIC5発現量が少ないメラノーマ細胞株に対しては細胞死を誘導せず、ZIC5発現の高い細胞株において細胞死を誘導した。また、BRAF阻害薬に対して耐性を獲得したメラノーマ細胞株に対して最もよくアポトーシスを誘導した。
また、「ZIC5調節分子をターゲットとする低分子化合物の同定」の為、これまでにZIC5結合タンパク質のスクリーニングを酵母two-hybrid 法で行い、約10個の候補タンパク質を同定している。これらの候補タンパク質をクローニングし、タグ付きの発現プラスミドを作製した。これを用いて、メラノーマ細胞内において候補タンパク質がZIC5と結合するかを免疫沈降法により検証したところ、７つの候補タンパク質についてZIC5と結合することが示唆された。
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| Strategy for Future Research Activity |
「ZIC5の核内存在量を低下させる低分子化合物の同定」においては、これまでに得られている２つの候補化合物について、候補化合物による細胞死誘導がZIC5の抑制を介しているかを検証する。ZIC5の抑制による細胞死誘導効果が確認された低分子化合物については、試験するがん細胞・正常細胞の種類を拡大する。正常細胞における毒性が低く、多くのがん細胞に有効であることが確認できた化合物に対しては、最終的にマウスを用いたin vivoの実験系における効果を検証する。また、必要があれば構造展開を検討する。これらの検証の結果、有効な化合物が得られなかった場合、さらに多くの低分子化合物ライブラリについて一次スクリーニングを行う。
また、「ZIC5調節分子をターゲットとする低分子化合物の同定」において、これまでに同定した７つのZIC5結合候補タンパク質について、ZIC5の薬剤耐性促進能に重要なタンパク質を同定する。ZIC5高発現細胞であるA375細胞においてZIC5結合タンパク質をRNAi法にて発現抑制し、BRAF阻害剤による細胞死誘導率が増大するか検証する。この実験により、薬剤耐性に関与しているZIC5結合因子が同定できる。さらに、ZIC5過剰発現系において、ZIC5結合タンパク質を発現抑制し、ZIC5による薬剤耐性の亢進を抑制できるタンパク質を同定する。さらに、これらの候補化合物がZIC5によるSTAT3の活性化を増強できるかを検証する。これらの検証により、ZIC5による薬剤耐性の亢進に寄与するZIC5結合タンパク質が同定される。さらに、結合タンパク質との相互作用を阻害した際に各種がん細胞の薬剤耐性が減弱するかを検証する。
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