2017 Fiscal Year Annual Research Report
生体イメージングを用いた栄養シグナルの遺伝子発現制御メカニズムの解析
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17H05060
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| Research Institution | University of Tsukuba |
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Principal Investigator |
武内 謙憲 筑波大学, 医学医療系, 助教 (70508093)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 栄養代謝 / 脂質代謝 / 転写 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
申請者は肝臓での脂質合成系調節に極めて重要なSREBP-1cの生体での発現調節機構を詳しく解析するため、独自にin vivo Ad-luc法という画期的なプロモーター解析手法と、転写因子発現ライブラリーTFELを開発し、肝臓でのSREBP-1cの発現調節に、絶食時に誘導されるKLF15が重要であることを見出した。KLF15は糖代謝に関与し、絶食時に発現が亢進することは知られているが、その調節機構は未だ解明されていない。そこで本研究ではKLF15遺伝子発現制御機構の解明を軸に「栄養シグナルの源流」に迫ることとした。
平成29年度においては、絶食において誘導されるKLF15の発現調節機構の解析を、in vivo Ad-luc法とTFELを用いて進めた。KLF15遺伝子には、KLF15-1aとKLF15-1cという転写開始点の異なるvariantは報告されている。申請者らの検討により肝臓ではKLF15-1aの発現量が絶食時に高いことを確認しており、KLF15-1aの転写調節解明が重要であると考えられた。KLF15-1a転写開始点から上流のExon1cまでのゲノム領域をKLF15-1aプロモーターとし、そのプロモーター領域をルシフェラーゼレポーター遺伝子につなげたアデノウィルスAd-KLF15-1a-lucは、絶食時の肝臓においてそのレポーター活性が上昇する結果がin vivo Ad-luc法により既に得られていた。そこで本研究開始直後より、KLF15-1aプロモーターを様々に欠損させたAd-lucコンストラクトを作成し、高解像度な重要領域の絞り込みを行った。その結果、絶食時に重要なゲノム領域の絞り込みに成功した。さらにTFELを用いて、その重要な領域に結合する因子の探索を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
平成29年度における研究計画において、KLF15-1aプロモーターを様々に欠損させたAd-lucコンストラクトを作成し、in vivo Ad-luc法にて絶食において誘導されるKLF15の発現調節機構に重要なゲノム領域の絞り込みを行う予定であった。しかし、in vivo Ad-luc法の実施過程で、対象とする発現調節領域が特殊な性質を持つこととが分かり、領域の選定に予想外の困難が生じた。そのため、in vivo Ad-luc法の条件を再検討し、改めてin vivo Ad-luc法を実施する必要があった。その再実施の結果、当初の研究計画通りに絶食時に重要なゲノム領域の絞り込みに成功し、さらにTFELを用いて、その重要な領域に結合する因子の探索を行うことが出来た。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成29年度での計画より引き続き、絶食におけるKLF15遺伝子の発現調節に重要な領域に結合する因子を探索し、分子レベルから生体レベルでの詳細な解析により、候補因子の正確な評価を行う。探索より得られた候補因子の絶食、摂食時の肝臓における遺伝子発現量を、qPCR法やマイクロアレイ法、RNA-seqにて比較定量する。同時に、それらの核内タンパク量をWestern blotにて確認する。さらに候補因子がそれらの領域内の配列に結合することをEMSA法ならびにマウスの肝臓の核分画を用いたChIP法、細胞でのレポーターアッセイを用いて確認する。候補因子が複数確認できた場合には、それぞれの候補タンパク同士の相互作用を免疫沈降法や、GST pulldown法などを用いて転写因子複合体に関する解析を行う。さらに候補因子の生体内での肝臓における役割を調べるために、ウィルスベクターなどを用いてマウス肝臓での候補因子のノックダウンを行い、生体レベルにて肝臓における候補因子によるKLF15遺伝子発現への影響を調べる。
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Research Products
(13 results)
