2018 Fiscal Year Annual Research Report
Identification of a master regulator of the differentiation of memory natural killer cells
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17H05071
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| Research Institution | University of Tsukuba |
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Principal Investigator |
鍋倉 宰 筑波大学, 生存ダイナミクス研究センター, 助教 (80550095)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 免疫学 / ナチュラルキラー細胞 / 免疫記憶 / ウイルス感染 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ナチュラルキラー（NK）細胞はウイルス感染細胞やがん細胞の排除に必須の免疫細胞である。NK細胞は標的を傷害して死滅する短寿命の細胞だと考えられていた。しかし近年、マウスサイトメガロウイルス（MCMV）の感染後、活性化受容体Ly49Hを発現するNK細胞は長期生存出来る記憶NK細胞に分化する事が示された。しかし記憶NK細胞分化におけるマスター制御因子は同定されていない。本研究では、研究代表者が作出したNK細胞特異的・時期特異的YFP発現（NKp46-CreERT2-Tg-Rosa26-YFP）マウスを用い、記憶NK細胞の分化と機能のマスター制御因子を同定する事を目的とした。
上記マウスにMCMVを感染させた後タモキシフェンを投与し、MCMVに応答するNK細胞をYFPにて標識した。感染マウスの脾臓に於いて、活性化Ly49H+ NK細胞及び活性化Ly49H- NK細胞、Ly49H+記憶NK細胞及びLy49H-記憶様NK細胞を可視化した。これらMCMVに応答したNK細胞サブセットと、未感染マウス由来ナイーブLy49H+ NK細胞及びLy49H- NK細胞をフローサイトメーターを用いて高度に純化した後、RNA-seqデータを取得した。その後、バイオインフォマティクス解析によってマスター制御因子候補として遺伝子Xを特定した。
海外共同研究者から遺伝子X欠損マウスを入手した。遺伝子X欠損マウスとNKp46-CreERT2-Tg-Rosa26-YFPマウスを交配して遺伝子X欠損NKp46-CreERT2-Tg-Rosa26-YFPマウスを作出した。更に、野生型及び遺伝子X欠損マウスからLy49H+ NK細胞を単離し、DAP12欠損マウスへ共移入した後にMCMV感染を行い、遺伝子XがMCMV特異的Ly49H+ NK細胞の増殖及び記憶NK細胞分化を制御する事を確認した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当該研究課題の年次計画に沿って、NKp46-CreERT2-Tg-Rosa26-YFPマウスと各NK細胞サブセットのRNA-seqデータを用い、記憶NK細胞の分化と機能のマスター制御因子候補Xを特定することに成功した。NK細胞に於ける遺伝子Xの機能は全く未知である。これまでに、バイオインフォマティクス解析によって遺伝子Xは以下の特徴を持つことが示された。(1) 核内移行シグナルを持ち、細胞質と核内に存在し、刺激によって細胞活性化にて核内移行する可能性がある。(2) Ly49H活性化シグナルを担うシグナル伝達分子DAP12及びDAP10の下流のシグナル伝達分子と結合する。(3) 記憶NK細胞分化に重要な役割を果たす活性化受容体DNAM-1の下流シグナル伝達分子によりリン酸化される。（4) パスウェイ解析に於いてNK細胞機能への寄与が強く示唆される。また、定量的RT-PCRにて、遺伝子Xは活性化Ly49H+ NK細胞にてナイーブLy49H+ NK細胞と比較して発現が上昇し、Ly49H+記憶NK細胞にて高発現が維持されることが発現が確認された。遺伝子X欠損マウスのNK細胞は、定常状態では野生型NK細胞と同様の正常な発生や表現型を示した。しかしながら、MCMV感染後の野生型及び遺伝子X欠損マウス由来Ly49H+ NK細胞の比較から、遺伝子XがMCMV特異的Ly49H+ NK細胞の増殖及び記憶NK細胞分化を制御する事を確認した。従って、遺伝子Xは記憶NK細胞の分化と機能を制御するマスター制御因子である可能性が強く示唆された。
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| Strategy for Future Research Activity |
前年度までの研究成果にて選択された記憶NK細胞分化のマスター制御因子候補遺伝子Xに関し、当該研究計画の年次計画に従って、以下の実験計画を試みる。
1. 遺伝子X欠損記憶NK細胞の分化実験：遺伝子X欠損及び野生型NKp46-CreERT2-Tg-Rosa26-YFPマウスに対し、マウスサイトメガロウイルス（MCMV）感染後にタモキシフェンを投与し、記憶NK細胞の存在比率と表現型解析から、遺伝子Xの記憶NK細胞分化における影響を評価する。
2. 遺伝子X欠損記憶NK細胞のin vivoアッセイ：MCMV感染遺伝子X欠損及び野生型NKp46-CreERT2-Tg-Rosa26-YFPマウスから記憶NK細胞を単離する。その後、記憶NK細胞をLy49H欠損マウスへ移入後にMCMVを感染させ、記憶NK細胞の二次増殖能を評価する。更に、記憶NK細胞をRag1欠損マウスへ移入し、MCMV未感染環境での生存と細胞死を評価する。
3. 遺伝子X欠損記憶NK細胞のin vitroアッセイ：MCMV感染遺伝子X欠損及び野生型NKp46-CreERT2-Tg-Rosa26-YFPマウスから記憶NK細胞を単離する。その後、腫瘍細胞株と共培養後、細胞傷害活性とインターフェロンγ産生能を評価する。更にIL-15培養下による細胞分裂・生存・細胞死を評価する。
4. マスター制御因子Xが制御する下流遺伝子の解析：MCMV感染野生型NKp46-CreERT2-Tg-Rosa26-YFPマウスから記憶NK細胞を単離し、マスター制御因子Xの細胞内局在を確認する。記憶NK細胞に於いてマスター制御因子Xが核内に局在する場合、MCMV感染遺伝子X欠損及び野生型NKp46-CreERT2-Tg-Rosa26-YFPマウスから記憶NK細胞を単離し、ATAC-seqデータを取得し、Themis2の有無によるエピゲノム変化を確認する。
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[Journal Article] The cis-Regulatory Atlas of the Mouse Immune System2019
Author(s)
Yoshida H, Lareau CA, Ramirez RN, Rose SA, Maier B, Wroblewska A, Desland F, Chudnovskiy A, Mortha A, Dominguez C, Tellier J, Kim E, Dwyer D, Shinton S, Nabekura T, Qi Y, Yu B, Robinette M, Kim KW, Wagers A, Rhoads A, Nutt SL, Brown BD, Mostafavi S, Buenrostro JD, Benoist C; Immunological Genome Project.
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Journal Title
Cell
Volume: 176
Pages: 897～912.e20
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
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