2017 Fiscal Year Annual Research Report
ヒト初期胚発生型リプログラミングによるがん化しない安定したiPS細胞の樹立
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17H05100
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| Research Institution | Keio University |
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Principal Investigator |
山田 満稔 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 助教 (40383864)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | ゲノム安定性 / ZGA / iPS細胞 / ES細胞 / 初期胚発生 / 卵子の加齢 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
iPS細胞は再生医療への応用が期待されるものの、成人の皮膚の体細胞から樹立したiPS細胞はゲノム不安定性に起因するがん化の問題が指摘されている。着床前期胚発生は、受精、胚性ゲノム活性化（Zygotic Genome Activation: ZGA）、分化全能性の獲得の過程を含み、ZGA型リプログラミングはゲノム安定性の高いiPS細胞の樹立につながると期待される。
そこで免疫染色法により加齢卵子と若齢卵子における紡錘体機能とミトコンドリアの動態の違いを検討した。8-12週齢（若齢）および12-14月齢（加齢）マウスのMII期卵子の紡錘体構造と染色体配列をTubulin（紡錘糸）、pH３（染色体）で染色した結果、加齢卵子で有意に異常を示した。一方細胞周期チェックポイント分子Survivinの局在は明らかな変化を示さなかった。ミトコンドリアの局在をMito Tracker染色で検討した結果、若齢ではミトコンドリアが均一に分散する様子が観察された一方、加齢卵子およびfragmentation卵子はまだら状に分布し、凝集が頻繁に観察された。胚盤胞発生率および細胞数は若齢で有意に高かった。
さらにYamanaka 4因子を用いて若齢由来３株、加齢由来３株のiPS細胞を樹立した。iPS細胞の核型解析を行い、いずれも正常核型であることを確認した。未分化マーカー遺伝子Oct4, Sox2, Klf4, Nanog, cMyc, Tertなどについて定量的リアルタイム解析を行った。結果、樹立したiPS細胞はこれらマーカー遺伝子を発現していることを観察した。細胞増殖能は加齢由来のラインの方が有意に早く、細胞周期チェックポイント機能の異常が示唆された。着床前期遺伝子Zfp371 ノックアウトES細胞は放射線照射によりDNA損傷マーカーヒストンH2AX（γ-H2AX）のリン酸化が亢進した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
（理由）「研究の目的」内において、初期胚発生と多能性獲得におけるZGAの分子生物学的機構の一端を明らかにすることを目的とした。本研究ではマウス体細胞からのリプログラミングの実験系が機能している。さらにゲノム安定性に関わるZGA遺伝子として、若齢に多く発現するZscan10遺伝子を過剰発現させることでゲノム安定性が回復することが知られており(Skamagki et al., Nat Cell Biol 2017)、同じZscan familyに属するZfp371に着目し、樹立したZfp371ノックアウトES細胞のゲノム不安定を証明している。これらの点を考慮し、ゲノム安定性の高いヒトiPS細胞の樹立のためのモデルとしての細胞ソースと実験系が確立できたことから、研究計画はおおむね順調に進展していると考えられた。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後はリプログラミング過程におけるZGA遺伝子群のより詳細な解析のため、マウスおよびヒトiPS細胞のリプログラミング過程における細胞を継時的に観察し、ZGA遺伝子が分化多能性獲得に寄与するか検討する。
RNA-seq解析によりリプログラミング過程の細胞を収集する。この際、Addgeneより購入するOc4-GFPのレポータープラスミドをtransfectionし、多能性マーカーを発現するコロニーを対象とする。ヒトとマウスの種による違いは初期胚発生の過程で報告されており（Lanner et al., Cell 2016）、本研究ではリプログラミング過程において共通した違いがないかどうか検討する。なお、ヒト体細胞には市販のBJ細胞（胎児包皮由来線維芽細胞）を用いてiPS細胞を樹立する。
ヒトiPS細胞において、ZGA homologue遺伝子（Hmgpi, Zflp371）が発現しているかどうか、免疫染色および定量的リアルタイムQ-PCR法にて解析する。発現が確認された場合には、特異的にZGA候補遺伝子（HMGPI, ZFP371）の発現を抑制するsiRNAをデザインし、iPS細胞に導入して、DNA stress markerの発現、細胞増殖能について検討する。ZGA候補遺伝子の発現抑制およびオフターゲット効果の有無をqPCR法で観察する。ZGA候補遺伝子ノックダウンiPS細胞が長期の培養を通じて未分化能を維持できるか検討するため、継代試験を行う。未分化マーカー（OCT4、NANOG、TRA1-60、SOX2）の免疫染色を行い、発現量や局在に変化がないかどうか観察する。
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| Remarks |
＜招待講演での発表＞1. 発表者名：山田満稔 2. 発表標題：【シンポジウム】ヒト受精卵のゲノム編集研究の現状と課題 3. 会名；上智大学生命倫理研究所 公開シンポジウム 4. 発表年：2017年
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