2017 Fiscal Year Annual Research Report
Development of heteroduplex oligonucleotide crossing the blood-brain barrier
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17H06109
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| Research Institution | Tokyo Medical and Dental University |
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Principal Investigator |
横田 隆徳 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 教授 (90231688)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
永田 哲也 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, プロジェクト講師 (50362976)
津本 浩平 東京大学, 大学院工学系研究科(工学部), 教授 (90271866)
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| Project Period (FY) |
2017-05-31 – 2022-03-31
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| Keywords | 核酸医薬 / Glut |
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| Outline of Annual Research Achievements |
当研究プロジェクトでは、Glut結合抗体クローンを取得するため、複数のライブラリからGlut結合抗体クローンのスクリーニングを行う。本年度、津本グループではGlut1の細胞外領域に結合性を示す単ドメイン抗体クローンを取得するため、Glut1ペプチドをアルパカに免疫し、抽出したRNAから構築したファージ提示免疫ライブラリから複数クローンのVHH抗体を取得した。しかし、取得した抗体について、細胞上での結合活性が確認できなかったため、抗体取得の段階での細胞株を用いたセレクションを検討している。また、同じFamilyに属するグルコーストランスポーターであるGlut4についても細胞外領域に位置するペプチドをアルパカに免疫し、抽出したRNAからファージ提示免疫ライブラリを構築するとともに、取得抗体の細胞上での結合活性評価のためのGlut4安定発現細胞株を樹立した。動物実験では 以前に使用したミセルの系で適切な投与前の絶食時間、糖負荷のタイミングについて検討を行った。またGlut1のみでなく脂質リガンドでも同様にFastingやGlucose controlで同様に脳内への取り込みが上昇するか検討した。具体的には24時間絶食後にChol-HDO 50mg/kgを投与し、1群では投与後30分後に20%Glucose投与、もう1群では未投与さらにもう1群ではFree feedingで脳内での遺伝子抑制効果を比較検討した。比較した3群では明らかな効果の増強及び低下は見られなかった。加えて神経難病である筋萎縮性側索硬化症の家族性ALSの原因遺伝子であるSOD1に対して新たな配列のスクリーニングを行った。200配列をデザインして企業と共同で最適化を行った。これまで他社で特許取得されている配列と同等の遺伝子抑制効果をもつ配列が取得できた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度はGlut結合抗体クローンを取得する手法について検討を行った。現時点では細胞上でGlutに結合活性を示す抗体クローンは得られていないものの、アルパカの免疫からRNAを抽出し、ファージ表面にVHH抗体を提示したファージ提示免疫ライブラリの作製手法を確立することができた。今後抗体取得の段階を検討することにより、目的に応じた抗体クローンの取得が可能になることが期待される。また、Glut1 / Glut4と同じファミリーに属するグルコーストランスポーターについてそれぞれ認識する抗体を取得し、抗体-抗原相互作用を精査し、交差反応について検証を行うことによって、より副作用が少なく目的に応じた抗体選択が可能になると考えられ、その基盤構築が進んでいる。また神経難病である筋萎縮性側索硬化症の原因遺伝子であるSOD1に対して標的配列も取得している。
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| Strategy for Future Research Activity |
本年度に引き続きGlut1 / Glut4結合抗体クローンを取得する。特に抗体選択の際、Glut安定発現細胞株を使用することにより、細胞上でGlutに結合活性を示すクローンを取得する。また、細胞外領域に存在するヘリックスを切り出したペプチドの免疫に加え、Glutを組換え蛋白質として調製してリポソームに包埋した抗原を免疫しての抗体取得についても試みる。ファージ提示法を活用した抗体選択の際、細胞外領域に結合する抗体に限定するため、細胞を用いたパニングやGlut包埋リポソームを活用した選択系の構築を目指す。各種選択法によって得られた抗体について、細胞上での抗原結合活性に加え、細胞内への取り込みについて評価を行い、さらには横田グループと連携しながらモデルマウスを活用してのin vivoでの体内動態へと順次移行していく。Glutの内在化と細胞内輸送を駆動する責任分子は血液中に分泌される分子であると仮定して、絶食開始から24時間後に血液中で特異的に上昇する分子を質量分析、または脳血管内皮細胞側でも発現するmRNAのアレイ解析を検討する。また新規に取得したSOD1に対する配列に関しては、安全性について検討する。
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