2017 Fiscal Year Annual Research Report
高分解能原子間力顕微鏡・分光法による生体分子間認識・相互作用力の直接可視化
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17H06122
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
山田 啓文 京都大学, 工学研究科, 教授 (40283626)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
小林 圭 京都大学, 工学研究科, 准教授 (40335211)
平田 芳樹 国立研究開発法人産業技術総合研究所, 生命工学領域, 主任研究員 (10357858)
岩田 太 静岡大学, 電子工学研究所, 教授 (30262794)
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| Project Period (FY) |
2017-05-31 – 2022-03-31
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| Keywords | ナノ計測 / 走査プローブ顕微鏡 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、周波数変調原子間力顕微鏡法（FM-AFM）を動作基盤とする高度３次元フォースマップ技術を用いた新たな分子機能イメージング法を確立し、生体分子の細胞生理機能における微視的役割を解明することを目指している。本年度は、下記２項目の研究テーマに注力して研究を推進した。
(1) ３次元フォースマップ法の高度化
リガンド-受容体分子間の相互作用マッピング計測法を確立するため、biotin修飾AFM探針とstreptavidin試料間の特異結合力をFM-AFMによって測定する際の種々の計測パラメータ、すなわちbiotin-探針間の結合距離（＝PEG長さ）、探針振動振幅、フォースカーブ測定時の探針掃引速度などのパラメータを最適化した。これによって効率的な生体分子間相互作用力マッピング計測を実現した。一方、ナノピペットを高精度に位置決めし、特異結合する標的分子を極微少量注入制御する技術を開発した。また、液中での電気泳動を応用して、負帯電ナノ微粒子を基板上に堆積することに成功した。
(2) 生体分子間認識・相互作用の可視化
［DNA複製初期過程可視化］DNA複製過程の第一段階では、２重鎖をほどくヘリカーゼ活性をもつMCMタンパク質がDNAと結合するが、このDNA-MCM複合体のFM-AFM観察を行った。観察像は、重なった２つの環状MCMがDNAと結合することを示したが、DNAとMCMの結合は、従来考えられていたようにDNA鎖が単純に２つのMCM環を通過するわけではなく、複雑な結合様式を取ることが示唆された。
［脂質結合タンパク質分子可視化］脂質膜に結合してチャネル状細孔を形成する毒素蛋白質の２次元結晶を可視化した。細孔形成は脂質組成に依存しており、少数分子で細孔を形成し２次元結晶化するヘモリシンと、受容体が必要となるストレプトリシンでは分子集積速度が大きく異なることが示された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究課題は、主に４つの研究サブテーマから構成されるが、本年度は、その中の下記２つのサブテーマの研究を中心として、新たな生体分子機能イメージングを確立するための具体的な研究を行った。
サブ研究テーマ「(1) ３次元フォースマップ法の高度化」においては、リガンド-受容体分子間の相互作用力マッピング計測法の確立に向けて、biotin探針およびstreptavidin試料を用いて、その計測パラメータの最適化を行った。FM-AFM動作時の探針はカンチレバーの共振周波数で振動しているが、振動時の探針に対しての非特異吸着は大幅に減少することが新たに見いだされた。これによって測定における特異／非特異結合の有無の判断は容易になり、相互作用力マッピング法の実現に向けて大きく前進した。さらに、ナノピペットを用いた極微少量の溶液吐出技術を構築・開発し，特定分子をターゲット試料近傍に局所注入することに成功した。また、サブ研究テーマ「(2) 生体分子間認識・相互作用の可視化」では、DNA複製時の第一段階において、ヘリカーゼ活性のあるMCMタンパク質がDNA鎖に結合する過程をFM-AFMにより可視化することに成功し、その観察結果から、MCM-DNA結合様式について、従来の解釈とは異なる新たな知見を得ることができた。
一方、脂質膜に吸着してチャネル状細孔を形成する毒素タンパク質分子(ヘモリシン:HL、ストレプトリシン：SLO)の２次元結晶を作製するとともに、FM-AFMによってその細部構造の分子分解能観察を行い、細孔形成が脂質組成に大きく依存することを見いだした。コレステロール成分の少ない脂質においては、SLOの分子集積速度は大きく低下し、コレステロールがSLO受容体としてはたらくことが示唆された。
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| Strategy for Future Research Activity |
生体分子の機能発現においては、生体分子の機能活性部位がもつ局所電荷密度分布が大きく影響することが知られており、特異的相互作用過程の理解に向けて、生体分子上の分子スケール電荷分布計測が強く求められている。これまでの研究により、３次元フォースマッピングによって、電気二重層力の空間分布計測が可能であることが分かり、生体分子周囲の局所電荷密度分布計測は進展しつつあるが、生体分子極近傍に存在する水和構造と電気二重層との相互関係については依然不明な点が多い。今後の研究では、高度３次元フォースマップ法を用いることで、水和構造力と分離した電気二重層力の検出を行い、より高精度な生体分子周囲の局所電荷密度計測法を確立する。また、ナノピペットを有する走査型イオン伝導顕微鏡を用いるアプローチも試み、局所電荷密度測定などの相互作用可視化に関する知見を得ることを目指す。
一方、DNA-タンパク質複合体における分子間相互作用の解析を進めるため、DNA複製過程の研究をさらに進展させる。これまで、真核生物DNAの複製初期過程の直接可視化を進めてきた。これに続く複製過程においては、DNA ヘリカーゼやDNA ポリメラーゼなどからなるDNA-タンパク質複合体が形成する「複製フォーク」が、DNA上を移動しながらその反応を遂行する。今後は、種々の高感度・高分解能AFM計測によって、上記DNA-タンパク質複合体の進行過程を直接可視化し、複製フォークの形成および停止のメカニズムの解明を目指す。
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Research Products
(38 results)
