2018 Fiscal Year Annual Research Report
Studies on mechanisms of biosynthesis of biomolecules via amino-group carrier protein and expansion of structural diversity of secondary metabolites
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17H06168
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
西山 真 東京大学, 生物生産工学研究センター, 教授 (00208240)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
富田 武郎 東京大学, 生物生産工学研究センター, 助教 (50447364)
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| Project Period (FY) |
2017-05-31 – 2022-03-31
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| Keywords | アミノ基キャリアタンパク質 / 生合成 / 二次代謝産物 / マレイマイシン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
①アザビシクロ環含有アミノ酸への生合成初期課程は、DADHの末端水酸基がまずVzb21によってスルホン化された後、αアミノ基がVzb12によってアセチル化され、その後、スルホン化によって活性化された末端水酸基とδアミノ基の間でアジリジン環構造を有するアミノ酸がVzb10/11により形成され、その後で保護基であるアセチル基が除去されると推測した。本年度は、DADHを基質として、Vzb21,12の連続反応、それにVzb10/11，さらにはVzb13を加えた系でin vitro反応を行った。その結果、予想される分子量を持つ化合物を生成することに成功した。
②s56-p1のN-N結合生成に関わるSpb40の機能として、MetRSドメインによってグリシンを活性化し、CupinドメインでそれとN6-OHリジンと縮合させ、生じたエステル中間体の形成を経て、N-N結合を形成することが示唆された。各ドメインの活性中心を変異した変異酵素は、活性を示さなかったが、それらを同一細胞に入れた場合は活性が検出されたことから、MetRSドメインが他のサブユニットのCupinドメインと相互作用し活性を示すことが示唆された。
③タイプIIAmCP遺伝子クラスターが、生合成機構未解明のマレイマイシンの生合成を担うことが明らかとなった。マレイマイシンは、AmCPに付加したグルタミン酸末端がセミアルデヒドになった後、未知の機構によりC3化合物の付加、アミノ化が進行し、最後に脱炭酸することにより生合成されるというその概略が明らかになった。
④その他のAmCPクラスの解析
これまで、不溶性タンパク質としてしか得られなかった２つのタンパク質を大腸菌で可溶性タンパク質として調製することに成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
これまで未知である酵素が全く知られていない反応を行うことから、アザビシクロ環生合成におけるアジリジン環含有アミノ酸の合成機構の解明には少し手間取るのではないかと心配したが、タンパク質の調製、さらにはin vitroの反応での生成物の確認が出来るまでに持ってくることが出来た。アジリジン環のアザビシクロ環の変換には、NRPSであるVzb7が関わることが推測された。各種遺伝子破壊株から単離された化合物のMS解析から、機能未知タンパク質Vzb5/6がVzb7のPCP上でアジリジン環含有アミノ酸のα－β不飽和化を行うことが示唆された。興味深いことにstand alone PCPであるVzb8の遺伝子破壊によっても、同α－β不飽和アミノ酸が蓄積することから、これまで例を見ないVzb7のPCPからVzb8(PCP)へのアミノ酸の移し替え機構の存在が示唆される。Vzb5/6による不飽和化も含めて、未知の興味深い機構が山積しており、その機構解明により、新たな合成生物学の道が開けると期待している。
Ficellomycinの環修飾および最終段階のジペプチド生成に関しては、in vitro再構成に成功している。生合成中間体を大量調製し、化学構造を決定を試みているところであり、近々学術誌に論文を投稿できると考えている。
マレイマイシン(MM)生合成に関しては、ほぼ全ての遺伝子破壊株の作製に成功し、その代謝産物の解析から、C5からC7(MM)の炭素鎖伸張は、まずC3ユニットが付加し、それが脱炭酸するという全体像が見えてきた。幾つかの生合成中間体の単離が可能であり、未知の生合成経路の解明は近いと考えている。
DADH生合成遺伝子に3つの遺伝子のみが付加された(転写因子と排出体を除く）遺伝子クラスターを見出し、それら全てのタンパク質の調製が可能となった。どのようなものが合成されるのか、in vitro、in vivoで解析していく。
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| Strategy for Future Research Activity |
研究の推進方策の大きな変更はない。アジリジン環の生合成を担う酵素のin vitroの評価系自体は確立できた、今後は化合物の構造決定を行う必要がある。これは、有機合成化学的に基質を調製し、それを用いた反応、酵素の結晶構造解析を行う予定である。
Vzb10/11、Vzb5/6、Spb40など全く新しい反応を触媒する酵素が研究対象となっており、その構造情報は反応機構の解明に不可欠である。これらのうち、Vzb10/11、Spb40については、タンパク質の調製に目処がついている。これらの結晶化を精力的に行うとともに、必要に応じて単粒子解析を用いた構造解析も行っていく。
その他、新規化合物については、生合成経路だけでなく、その最終産物の生物活性も他機関への研究強力を仰いで検討していきたい。
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