2019 Fiscal Year Annual Research Report
Development of soluble expression technology and utilization of enzymes from plants and animals
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17H06169
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| Research Institution | Toyama Prefectural University |
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Principal Investigator |
浅野 泰久 富山県立大学, 工学部, 教授 (00222589)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
山口 拓也 筑波大学, 生命環境系, 助教 (00748527)
日比 慎 富山県立大学, 工学部, 准教授 (30432347)
松井 大亮 富山県立大学, 工学部, 助教 (40748513)
中野 祥吾 静岡県立大学, 食品栄養科学部, 助教 (80748541)
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| Project Period (FY) |
2017-05-31 – 2022-03-31
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| Keywords | ヒドロキシニトリルリアーゼ / 可溶性変異 / 遺伝子発現 / 節足動物 / 酵素 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
課題１
1. 複数の変異点に同時に変異導入が可能な方法を構築した。β-シートなどにホットスポットを予測するプログラムをINTMSAlignに追加した。INTMSAlignによる予測とTat-Split法を用いたスクリーニング法を連結した。他大学などと可溶性発現を検討し、酸化還元酵素の可溶性発現を顕著に向上させた。Thermus thermophilus 由来のタンパク質群の異種発現情報を用いて機械学習を行い、変異導入による可溶性発現を行った。2. HiSol法にタンパク質の立体構造データを反映した新規可溶性変異点同定手法、HiSol2法の開発と実証実験を進めた。ROSETTAによりHiSol法で予測した可溶性変異点が、目的タンパク質を安定化するスコア (HiSol2値) を定義した。
課題2
1. βシート構造に富むヤンバルトサカヤスデ由来HNLに新たな可溶性ホットスポットを見出した。ヤスデ由来のHNLの封入体のリフォールディングにより酵素を調製した。リフォールディングにより可溶性酵素と異なったジスルフィド結合が確認された。 2.ChuaHNL遺伝子は多くのChuaHNL-like遺伝子とクラスターを形成し、ChuaHNLの祖先遺伝子がゲノム上で多重化しHNL活性を獲得したと推察した。RNA-seq解析からChuaHNL-like遺伝子は触覚で高発現していた。ヤスデにアルドキシム脱水酵素様P450を見出した。3.HNLを用いたストレッカー反応により、2-メチルアミノ-2-フェニルアセトニトリルを合成した。収率向上のためニトリラーゼやニトリルヒドラターゼとのカップリング反応を行った。4.変異導入により、Bacillus sp. OxdB-1由来アルドキシム脱水素酵素のX-線構造解析に成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
課題１
1. タンパク質β-シート構造の疎水性度への影響を確認し、β-シート構造が豊富な糸状菌Galactose oxidase に、本手法の有効性を検証できた。水酸化酵素の顕著な可溶性発現について構造との関連を解析できた。Thermus thrmophilus由来タンパク質配列と、大腸菌での可溶性発現の情報について、人工知能を用いた機械学習（富山県大、情報工学科と共同）を行い、タンパク質の可溶性割合を算出した。Thermus thermophilus由来酵素8種類の酵素などの機械学習により変異導入で活性を確認できた。2. INTMSAlign（予測）とTat-Split法（検出）を連結できた。
課題2
1. ヤスデHNLを大腸菌にて可溶性に発現させた。また、リフォールディングにより酵素を生産した。ヤスデ由来HNLのリフォールディングにより、ジスルフィド結合の掛け違い（異なった位置のジスルフィド結合）を確認できた。PNGase AおよびLC-MSによりChuaHNLに短い糖鎖を確認した。2.ヤスデのゲノム解析ができつつある。ChuaHNL遺伝子は多くのChuaHNL-like遺伝子とクラスターを形成し、祖先遺伝子がゲノム上で多重化する過程でHNL活性を獲得したと推察できた。触覚でHNLホモログの高発現を認めた。約100種のP450遺伝子を発見し、アルドキシム脱水活性を有するP450を複数見出した。シアン解毒酵素遺伝子を大腸菌で発現させ活性を検出した。3. Bacillus sp. OxdB-1由来アルドキシム脱水酵素の結晶構造解析ができた。アルドキシム脱水酵素の4,5-ジヒドロイソキサゾール類化合物に対するKemp 脱離反応による新しい光学分割反応を発見し、医薬中間体の光学活性(R)-β-ヒドロキシニトリルを合成した。残存基質から光学活性な(S)-β-ヒドロキシニトリルを得た。
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| Strategy for Future Research Activity |
課題１
1．β-シート構造においてもアミノ酸残基の疎水性が重要な因子であると考え、他のβシート構造中の可溶性変異についても検討する。新たなモデルタンパク質に対して、INTMSAlignとTat-Split法を連結した多点変異導入法を組み込む。各大学から報告をまとめると共に、再度発現条件の検討が必要なタンパク質については再検討を行う。Solubility scoreを利用した変異実験の結果を、再度機械学習にフィードバックし、成功確率を向上させる。2. スレオニン脱水素酵素を用いた実験で、タンパク質部分ごとに向上する機能が異なることを発見したので、INTMSAlignプログラムにタンパク質部分に分割して計算する機能を付与する。
課題2
1. ヤスデ由来HNLのリフォールディング条件をさらに検討し大量生産する。2.ヤスデのシアン代謝に関わる多くの酵素遺伝子、ChuaHNL、ChuaHNL-like、マンデロニトリル生合成酵素群、シアン解毒酵素群を中心に機能解析を行う。大量のヤスデから、ChuaHNLを精製し糖鎖構造を解明する。大腸菌で発現したChuaHNLホモログ酵素は不溶化したため酵母を用いて発現させる。3.トヤマキシャヤスデParafontaria laminataのX-線結晶構造解析を行い、合理的に立体選択性の改良を行い、医薬品中間体合成に適用する。HNLをフロー合成に用いて、効率よく医薬品中間体を合成する。HNLを用いるストレッカー合成について、ニトリラーゼなどの酵素とのカップリング反応を検討し、変異導入によるイミンへの反応性を向上させる。4. アルドキシム脱水酵素の触媒するKemp 脱離反応による光学分割反応について、さらに基質特異性を詳細に明らかにし、医薬品中間体などの合成に利用する。
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