2020 Fiscal Year Annual Research Report
Development of soluble expression technology and utilization of enzymes from plants and animals
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17H06169
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| Research Institution | Toyama Prefectural University |
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Principal Investigator |
浅野 泰久 富山県立大学, 工学部, 教授 (00222589)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
中野 祥吾 静岡県立大学, 食品栄養科学部, 助教 (80748541)
松井 大亮 立命館大学, 生命科学部, 助教 (40748513)
山口 拓也 筑波大学, 生命環境系, 助教 (00748527)
日比 慎 富山県立大学, 工学部, 准教授 (30432347)
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| Project Period (FY) |
2017-05-31 – 2022-03-31
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| Keywords | ヒドロキシニトリルリアーゼ / ヤンバルトサカヤスデ / アルドキシム脱水酵素 / アルドキシム-ニトリル経路 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
課題１ 1.不溶性発現が問題となっている2-オキソグルタル酸依存型水酸化酵素に対して、INTMSAlignを用いた可溶性変異の検討を行い、可溶性発現を大幅に改善した。Solubility scoreを利用した変異実験の結果を、再度機械学習にフィードバックするとともに、コドン配列を利用して学習機を開発した。2.タンパク質の可溶性変異点予測プログラムを開発するにあたり、モデルタンパク質に対して部分的にコンセンサス変異を導入することで、可溶性度の制御に成功した。
課題2 1.ChuaHNLのリフォールディング条件をさらに検討し、大量生産系を構築した。ChuaHNLを均一に精製し、糖鎖の切り出し、および精製を行い、その糖鎖構造を解明しつつある。2.ヤンバルトサカヤスデのシアン代謝に関わる多くの酵素遺伝子、ChuaHNL、ChuaHNLホモログ、マンデロニトリル生合成酵素群、シアン解毒酵素群を中心に機能解析を行った。3.トヤマキシャヤスデParafontaria laminataのX-線結晶構造解析を行い、合理的に立体選択性の改良を行い、2-Chloro-(R)-Mandelonitrileなどの医薬品中間体合成に適用した。新たに、植物アマLinum usitatissimumのR-ヒドロキシニトリルリアーゼ（LuHNL）のX線構造解析を行った。ニトリラーゼAY487533に着目し、INTMSAlign_Anglerを用いる新規なニトリラーゼのスクリーニングを行った。元の配列に対して、相同性が低いが目的の活性を有するニトリラーゼを得た。4.アルドキシム脱水酵素の触媒するKemp 脱離反応による光学分割反応について、さらに基質特異性を詳細に明らかにし、医薬品中間体などの合成に利用した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
課題1 1.不溶性発現が問題となっている2-オキソグルタル酸依存型L-ピペコリン酸水酸化酵素の可溶性発現および耐熱性を顕著に向上させる変異を見出した。アミノ酸脱水素酵素などの酵素において、アミノ酸配列ではなくコドン配列を利用して70%程度の正答率を示す学習機を作成できた。2.L-スレオニン脱水素酵素をモデルとして2領域同時にコンセンサス変異を導入すると、その可溶性度は天然酵素と比べて 劇的に向上した (200-400%)。
課題2 1.ヤスデ由来HNLのリフォールディング条件を検討し、酸化還元状態がリフォールディング効率に重要であることを明らかにし、大量生産が可能となった。ヤスデ1 kgから単一のChuaHNLを得、糖鎖構造を解析できる手法を構築した。2.ChuaHNLの近傍に座乗するChuaHNLホモログはHNL活性を有することを見出した。アルドキシム脱水酵素と異なる反応を触媒する代謝酵素を見出した。シアン解毒に関与するロダニースを大腸菌で発現し、諸性質を解明した。3.トヤマキシャヤスデParafontaria laminataのHNLおよびLinum usitatissimumのR-ヒドロキシニトリルリアーゼ（LuHNL）のX線構造解析を行った。立体選択性を改良した。ニトリラーゼAY487533に着目し、INTMSAlign_Anglerを用いて、新しいニトリラーゼを得、さらに改変した。4.結晶化が難しいBacillus sp. OxB-1由来アルドキシム脱水酵素（OxdB）のアミノ酸を置換することで結晶構造解析に成功し、活性中心の解析を行った。アルドキシム脱水酵素が触媒するKemp 脱離反応により、ジヒドロイソキサゾールを不斉開環し、キラルヒドロキシルニトリルを合成する反応を開発した。
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| Strategy for Future Research Activity |
課題1 1.βシート構造を有する多数の酵素タンパク質の可溶性変異についても検討する。新たなモデルタンパク質に対して、INTMSAlignを用いて可溶性変異の検討を行う。機械学習には容易に想像できない様々な要素が関与しているため、「コドン」や「アミノ酸の性質」、「二次構造」などといった様々な要素と可溶性確立との相関を計算し、結果が出次第、論文を投稿する。2.酵素・タンパク質の可溶性度は変異導入により相加的に向上するのではなく、複数の変異を同時に導入することで、劇的に向上させられる。このような部分コンセンサス設計で得られた知見を論文として投稿し、そのアルゴリズムをINTMSAlignプログラムに実装を進める。
課題2 1.リフォールディングにより大量生産したヤスデ由来HNLの酵素性質の検討を行うとともに、HNLおよびニトリラーゼを組込んだフロー合成系の最適化を行い、医薬中間体を合成する。ChuaHNLの糖鎖構造を解明する。2.バキュロウイルスー昆虫細胞発現系を用いて、ChuaHNLとChuaHNLホモログのHNL活性を定量的に比較する。ヤスデのシアン代謝に関わる酵素遺伝子の発現組織解析をqRT-PCRを用いて行う。ヤスデのゲノム解析結果を公表する。3.LuHNL のX線構造解析を完成する。シアノヒドリン分解におけるLuHNLの反応機構を解明し、LuHNLがアルコールデヒドロゲナーゼ活性を失った理由を構造レベルで解明する。4.OxdBについて基質とのドッキングシミュレーションを実施するとともに、論文を執筆する。
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