2017 Fiscal Year Annual Research Report
The development of innovative nitrification and denitrification process using anoxygenic phototrophic bacteria
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17H06243
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| Research Institution | Tokyo Metropolitan University |
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Principal Investigator |
花田 智 首都大学東京, 理学研究科, 教授 (10357791)
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| Project Period (FY) |
2017-06-30 – 2020-03-31
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| Keywords | アンモニア酸化 / 光合成細菌 / バクテリオクロロフィル / 硝化 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
廃水処理プロセスの効率化で問題となっている硝化・脱窒プロセスを、酸素非発生型光合成細菌を使って、革新することが本研究の目的である。従来の硝化（アンモニアから亜硝酸・硝酸への酸化）は硝化細菌（アンモニア酸化細菌と亜硝酸酸化細菌）によって好気的（酸素存在下）で進行するプロセスと考えられてきた。しかし、酸素非発生型光合成細菌による亜硝酸の嫌気的酸化が発見され、硝化プロセスを効率化する新たなアプローチとして注目され始めた。亜硝酸だけではなくアンモニアも光合成電子伝達の電子供与体に成り得るが、アンモニアを嫌気的に酸化できる酸素非発生型光合成細菌は未だ発見されていない。これはアンモニア酸化活性が光によって阻害されるという事実に阻まれて、研究が行われてこなかったことに因る。確かにアンモニア酸化作用は光照射に紫外-青色光照射によって著しく低下するが、酸素非発生型光合成細菌の光合成に用いられる近赤外光では阻害は全く見られない。特定波長（700nm）以下を遮断するフィルターによってアンモニア酸化反応を阻害することなく、酸素非発生型光合成細菌を培養し得る培養システムを設計することができる。また、このシステムは(670nmに長波長側の吸収帯をもつ）クロロフィルを光合成色素として有する藻類やシアノバクテリアなどの酸素発生型の光独立栄養生物の生育も阻害することもでき、アンモニア酸化酸素非発生型光合成細菌のみを効率的に得ることができものであると言える。この培養システムを用いて海洋や陸水、または温泉などの様々な環境中から採取した分離源を用いて、アンモニア酸化酸素非発生型光合成細菌の世界に先駆けての発見を目指す。更には分離培養に成功した酸素非発生型光合成細菌を用いて、光によってコントロール可能な硝化・脱窒プロセスを提案することが最終目標である
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
赤外光フィルター（>700nm)を付けた投光装置を装着した光合成培養装置を構築し様々な海洋サンプルを分離源とした培養実験を開始した。その中で松島（仙台）の海岸で採取されたサンプルを用いての培養で、光合成細菌の増殖が認められた。用いた培養液は無機培地にアンモニアを硫酸塩(硫安)として添加したものであり、アンモニア以外の電子供与体となり得るものは一切含まれていないことから、アンモニア酸化光合成により光合成細菌が増殖したものと考えた。ただし、この培養は未だ複合系であり、当該酸素非発生型光合成細菌だけではなく様々な海洋性の非光合成細菌を依然として含んでいる。色素分析の結果から当該酸素非発生型光合成細菌はバクテリオクロロフィルａとカロテノイドを含んでいることが明らかとなり、またin-vivoスペクトルの解析からプロテオバクテリア門に属する紅色細菌であると推定された。紅色細菌に存在する光合成光化学反応中心タンパク質の遺伝子配列（pufLM）のPCR増幅を行い行ったところ、単一のPCR産物を得ることができた。その配列情報に基づく解析をおこなったところ、当該酸素非発生型光合成細菌は海洋性紅色硫黄細菌であるMarichlomatium属細菌に近縁なものであることが明らかとなった。現在、この光合成細菌を単離すべくGTGアガロース平板培養を用いた分離培養を繰り返し行った。この平板培養において酸素非発生型光合成細菌のコロニー形成は見られたものの、海洋性の非光合成細菌の増殖も同時に見られ、且つGTGアガロースの溶解が起きていることが確かめられた。これは共存する海洋性非光合成細菌が寒天を溶解し、GTGアガロース溶解物である糖が当該酸素非発生型光合成細の光合成を支える基質となっている可能性を示唆されため、ゲル化剤をゲランガムに変更し平板培養を開始した。
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| Strategy for Future Research Activity |
本年度は、特定波長以下を遮断する光照射によってアンモニア酸化反応を阻害することなく、酸素非発生型光合成細菌を培養 することのできる培養システムの設計と改良、そして様々な環境中からのアンモニア酸化能を有する酸素非発生型光合成細菌の複合培養系の獲得および純粋分離を行う。なお、特定波長以下を遮断する光照射は、1)700nm以下の波長をカットして近赤外光を透過するカットフィ ルタを白色電球に設置しする分離源としては、海水、潮だまりだけではなく、湖沼の底泥、温泉水などの淡水環境も対象とし、採取場所に合わせた温度設定での培養を行う。液体培地は、無機培地にアンモニアを硫酸塩(硫安)として添加したものを用いる。pHは中性か採取場所に合わせた設定とする。ブチルゴム栓付き試験管の気相は窒素－二酸化炭素(80:20)により置換し、酸素の混入を避け、嫌気環境を達成する。酸素非発生型光合成細菌の生育に関しては、それらが含有するバクテリオクロロフィルaの蛍光を赤外線カメラで直接読み取ることで判断する。この鋭敏な色素可視化装置を用いることにより、低濃度の酸素非発生型光合成細菌であっても簡便に検出することが可 能となる。酸素非発生型光合成細菌の生育の見られた液体培養物からのアンモニア酸化酸素非発生型光合成細菌の分離は、GTGアガロースまたはゲランガムをゲル化剤とした無機平板培養(アンモニアは硫安として添加)によって行われる。嫌気的環境の達成には酸素吸収剤であるアナエロパックを用いる。平板プレート上に生じたコロニーをピックアップし、再度、画線することにより、純粋分離を行う。
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