2018 Fiscal Year Annual Research Report
Revertant mosaicism in congenital ichthyoses
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17H06271
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
清水 宏 北海道大学, 医学研究院, 教授 (00146672)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
乃村 俊史 北海道大学, 大学病院, 講師 (50399911)
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| Project Period (FY) |
2017-06-30 – 2020-03-31
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| Keywords | 先天性魚鱗癬 / revertant mosaicism / 組換え |
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| Outline of Annual Research Achievements |
先天性魚鱗癬などの遺伝性角化症（ichthyosis with confettiなど）では、身体の一部において体細胞組換え（体細胞レベルでの相同組換え）により病因遺伝子変異が消失し、自然治癒する現象が知られており、これをrevertant mosaicism（復帰変異モザイク）と呼ぶ。本研究では、遺伝性角化症において体細胞組換えによる自然治癒部位が多発する機序を解明するために、変異タンパク質と野生型タンパク質を安定発現する細胞株をTet-On/Offシステムを用いてそれぞれ樹立した。まずはじめに、DNA double-strand breakの指標であるγH2AXを免疫染色とWestern blotを用いて解析し、変異タンパク質がDNA double-strand breakを引き起こすか検討したが、変異タンパク質発現による変化は認められなかった。しかし、変異タンパク質発現下でヒドロキシウレアを用いて複製ストレスを与えると複製ストレス応答に変化を生じ、DNA修復関連タンパク質（Rad51など）の発現に変化が見られることがわかった。現時点ではヒドロキシウレア投与以外の複製ストレスや、X線照射などによるDNA double strand breakに対する応答については検討できていないが、これらの結果は、変異タンパク質が発現すると複製ストレス応答の異常を介してbreak-induced repairが引き起こされ、相同組換えが誘導されている可能性を示唆するものである。また、ロリクリン角皮症という遺伝性角化症において体細胞組換えによるrevertant mosaicismが見られることを世界で初めて見出し、論文発表した（Suzuki et al. Life Sci Alliance 2019）。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
これまでの実験結果から、変異タンパク質が直接DNA double strand breakを引き起こし組換えを増加させるのではなく、複製ストレス応答の変化を介して組換えを増加させる可能性が示唆された。これは当初の仮説とは異なるものの、変異が組換えに与える影響と組換えを増加させる機序の方向性を確立することができたことから、研究計画は概ね順調に実施されていると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
DNA fiber assayを用いた複製フォーク解析を行い、変異タンパク質発現が複製ストレスを誘導するか検討する。また,
変異タンパク質がDNA double strand breakの修復過程に影響を与えるか検討するために、安定発現細胞株にX線照射やエトポシド添加を行い、評価する。これまでヒドロキシウレアを用いて複製ストレス応答を検討しているが、ヒドロキシウレア以外の薬剤、例えばアフィディコリンの投与下でも同様の結果が再現されるか検討を行う。
Array cardを用いて、変異タンパク質発現前後での遺伝子発現の違いを検討し、何が複製ストレス応答の変化に重要なのか明らかにする。
変異が組換えにより消失した細胞が増殖し肉眼で確認できるサイズの正常皮膚を呈するためには、変異細胞との競合に打ち勝つ必要がある。正常化細胞と変異細胞を用いて、コロニー形性能や細胞増殖能を測定し、この点を解明する予定である。
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