2017 Fiscal Year Annual Research Report
| Project/Area Number |
17H06274
|
|---|
| Research Institution | The University of Tokyo |
|---|
Principal Investigator |
北野 健太郎 東京大学, 医学部附属病院, 助教 (70647073)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
長山 和弘 東京大学, 医学部附属病院, 助教 (00647935)
似鳥 純一 東京大学, 医学部附属病院, 助教 (40424486)
安樂 真樹 東京大学, 医学部附属病院, 特定研究員 (70598557)
垣見 和宏 東京大学, 医学部附属病院, 特任教授 (80273358)
中島 淳 東京大学, 医学部附属病院, 教授 (90188954)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2017-06-30 – 2020-03-31
|
| Keywords | 肺再生 / 再生医療 / 大動物モデル / 脱細胞化 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の目的は、ミニブタモデルにおいて自己細胞をもとに再生肺を構築し生体内で長期間ガス交換能を維持できるか検証を行うことである。再生肺の構築のために我々は脱細胞化技術を用いた。本研究の達成のために我々は次の4つの事項を成し遂げる必要があった。1つ目は肺の脱細胞化を実現させることである。2つ目はブタの自己細胞を分離培養することである。3つ目は脱細胞化された肺スキャフォールドに、自己細胞由来の細胞を配置することである。4つ目は構築された再生肺を適切に移植させることである。
1つ目の事項である肺の脱細胞化は既報の方法を用いて施行した。脱細胞化処理された肺の組織染色やDNA定量を通じて、適切な脱細胞化が行われていることが確かめられた。2つ目の事項であるレシピエント自己細胞の分離培養であるが、これはブタの切除肺から酵素法ならびに抗体を用いた方法で気道上皮系であるKRT5+p63+細胞と、血管内皮系であるCD31+細胞を分離培養させた。それぞれの系統の細胞を培養増殖させた後に免疫染色ならびにフローサイトメトリーを行い、適切に特徴化され、目標とした細胞群が得られたことを確認した。3つ目の事項である、脱細胞化された肺への自己細胞由来の細胞の配置は、既報に則った方法で施行した。構築された肺組織の染色を行い、脱細胞化され細胞が全く見られなかった肺組織に、自己細胞が配置されていることを確認した。4つ目の事項である、再生肺の移植であるが、我々は現在までに2件施行した。超急性期におけるガス交換能について、同種他家肺移植をコントロール群として検証した。結果は学会、誌上報告で公表予定である。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
ブタ肺由来の細胞分離は予定していた平成30年3月までに達成できなかったが、研究方式を見直すことで、繰越申請書での計画変更通り平成30年7月にはブタ肺由来の上皮・内皮細胞の分離・培養は実行できた。2-3週間の培養で、各々の細胞が10の5乗から6乗個程度まで増殖することを確認した。ブタ肺由来の気道上皮細胞はラットやヒトで報告されている手法を踏襲して分離培養を実行した。平成30年3月までに実行できなかった理由は培養中の感染であった。我々は抗生物質や滅菌フィルターの使用を頻回に行うことで細胞の感染の問題を克服し、ブタ肺組織500-1000mgから2-3週間の培養で最大10の6乗程度まで感染することなく安定して培養増殖できる手法を確立した。ブタ肺由来の血管内皮細胞も同様にラットやヒトで報告されている手法を踏襲した。平成30年3月までに実行できなかった理由は意図していない線維芽細胞の増殖により目標とする血管内皮細胞が駆逐されてしまうということにあった。セルソーターを用いた手法を計画したが、手技の煩雑さから抗体の結合したビーズをマグネットで回収するMACS（Magnetic-activated cell sorting）を用いて、血管内皮のマーカーであるCD31を発現した細胞群のみを得た。ブタ肺組織500-1000mgから2-3週間の培養で最大10の6乗程度まで安定して培養増殖できる手法を確立した。しかし長期間にわたる培養管理の困難から、当初の実施計画である10の9乗個程度の細胞数に増殖するまでの期間の検討は行えていない。
また、同種肺移植のモデル確立において、技術的困難により2週間生存を維持する手術・術後管理は達成できていない。
|
| Strategy for Future Research Activity |
10の9乗個の細胞により構築した再生肺の移植を行い長期生存させるという計画であったが、細胞の10の9乗個までの増殖ならびに同種肺移植の長期生存が困難であったという理由で計画を変更し、2-3週間の培養で得られた各々10の5乗から6乗個程度の細胞で構築した再生肺の移植を行い超急性期のみのガス交換能の検討を行った。今後は当初の計画である細胞の10の9乗個程度の細胞数までの増殖をいかにして行うかの探究ならびに同種肺移植の長期生存モデル作成のための安全な手技、周術期管理の確立が必要である。
|
