耐熱性色素依存性D-乳酸脱水素酵素の機能・構造解析とバイオセンサー素子への応用

2017 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 17H07257
• Research Institution: Ritsumeikan University
• Principal Investigator: 林 順司 立命館大学, 生命科学部, 助教 (20802101)
• Project Period (FY): 2017-08-25 – 2019-03-31
• Keywords: 酵素工学 / 酵素 / 好熱菌 / 構造生物学

Outline of Annual Research Achievements

本申請研究の目的は、立体構造情報を基にバイオセンサー素子として最適な色素依存性D-乳酸脱水素酵素（Dye-DLDH）を開発することである。本申請研究はD-乳酸の新規測定法開発において重要な役割を果たすと考えられる。
当該年度は、Dye-DLDHホモログの検索・大腸菌における発現系構築・触媒活性の同定・酵素精製・結晶化スクリーニングを実施した。
超好熱菌・好熱菌のゲノム情報に基づき機能が特定されていないDye-DLDHホモログの検索を行った結果、10種類以上のDye-DLDHの存在を推定した。これらをコードする遺伝子に関して、クローニングと大腸菌における発現系の構築を行い、好熱菌Geobacillus kaustophilusのホモログに関して可溶性画分への発現が認められた。触媒活性の同定はNative-PAGEを用いた活性染色法によって行った。その結果、発現遺伝子からDye-DLDH活性が得られた。各種クロマトグラフィーによって本酵素の精製を行い、電気泳動的にほぼ単一に精製することに成功した。本酵素の結晶化スクリーニングにも着手し、タンパク質と思われる結晶を得た。
今後は、本結晶に関して結晶化の最適化条件を検討し、X線回折実験を行うことを予定している。また、本酵素の酵素化学的諸性質の解明を行い、バイオセンサー素子としての有用性を評価していく。
さらに、発現に成功しなかったホモログに関しても発現系を再検討する。複数の酵素を比較することで、バイオセンサー素子として優れた酵素を選抜する。

Research Progress Status

29年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

29年度が最終年度であるため、記入しない。