2018 Fiscal Year Annual Research Report
メタン発生・分解酵素に学ぶ炭素源有用物質変換を目指した新規生体金属触媒の創成
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17J00008
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
宮崎 雄大 大阪大学, 工学研究科, 特別研究員(DC1)
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| Project Period (FY) |
2017-04-26 – 2020-03-31
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| Keywords | メタン発生酵素 / メタン生成 / F430 / ニッケル / テトラデヒドロコリン / ミオグロビン / ジデヒドロコリン / シトクロムb562 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
近年、人工生体触媒による環境負荷軽減型の物質変換が注目されており、その実現には天然酵素の反応制御の仕組みの理解と再現が必要である。本研究では、メタン菌中においてメタン発生と分解を制御し、補因子にニッケル錯体 (F430)を有するメチル補酵素M還元酵素 (MCR)に注目し、反応機構解明と温和な条件でのC1源効率変換を可能とする人工生体金属触媒の開発を目的としている。昨年度までに、ヘムタンパク質の天然補因子ヘムの除去と人工補因子の導入を行う「再構成法」を利用することで、タンパク質を基盤とした機能モデルの構築を達成している。具体的には、モデル錯体としてニッケルテトラデヒドロコリン、タンパク質としてミオグロビンを選択し、これらを複合化した再構成ミオグロビンを用いた外部基質を炭素源とする触媒的メタン発生を報告した。本年度はミオグロビンに変異導入を実施し、活性中心近傍のアミノ酸残基の酵素反応への影響を検討した。特に活性中心上部に存在するヒスチジンをアラニンに変化させるとメタン発生量が減少し、ヒスチジンがメタン発生に必要な働きをすることを明らかにした。さらに、より天然に近い基質からのメタン発生を検討した。モデル錯体として、ニッケル1価種の高い反応性が期待されるニッケルジデヒドロコリンを新規に設計・合成した。一方、タンパク質としては活性中心近傍にメチオニンを有するシトクロムb562を選択し、調製・精製した。これらを複合化した再構成シトクロムb562に対し、光増感剤を用いてニッケル1価種を系中にて発生させることにより、メタンの発生を観測した。質量分析より反応後にメチル基一つに相当するタンパク質骨格の質量が減少していることを確認した。これは機能モデル内部におけるメチオニンのスルフィド結合の開裂に伴うメタン発生を示唆する結果である。上記の研究成果は国内外の学会にて発表している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究では、メタン菌中においてメタン発生と分解を制御し、補因子にニッケル錯体 (F430)を有するメチル補酵素M還元酵素 (MCR)に注目し、反応機構解明と温和な条件でのC1源効率変換を可能とする人工生体金属触媒の開発を目的とする。本年度は、反応機構解明に向け、タンパク質を基盤とした複数の機能モデルの設計・構築と反応性評価を計画し、実施した。まず、昨年度までに報告した機能モデルを用いた外部基質からの触媒的メタン発生に対し、タンパク質骨格への変異導入を行うことで、酵素反応へのタンパク質骨格の及ぼす影響を検討した。モデル錯体としてニッケルテトラデヒドロコリン、タンパク質としてミオグロビン変異体を選択し、これらを複合化した再構成ミオグロビン変異体を評価した。特に、活性中心上部に存在するヒスチジンをアラニンに変異するとメタン発生量が減少した。本残基がメタン発生反応に重要な役割を果たしていることが明らかとなり、酵素反応において活性中心の反応性がタンパク質骨格により高度に制御されることを実証した。さらに、より天然の基質に近いスルフィド結合開裂に伴うメタン発生を検討した。モデル錯体としてニッケルジデヒドロコリン、タンパク質として活性中心近傍にメチオニンが存在するシトクロムb562を選択し、それぞれ設計・調製した。これらを複合化した再構成シトクロムb562に対し、光増感剤存在下、可視光照射によるニッケル中心の還元を行うことにより、メタンの発生を確認した。反応前後における質量分析より、メタンがメチオニンのスルフィド結合開裂に由来することが示唆された。本実験ではこれまでほとんど報告されていないスルフィド結合開裂に伴うメタン発生を確認した。上記のように、複数の機能モデルに関して、設計・構築から反応性評価までを実施しており、当初の研究計画に基づいておおむね順調に進展していると判断する。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後はこれまでに実施した機能モデルの調製とその同定を展開し、異なる性質を有するモデル錯体とヘムタンパク質のタンパク質骨格を組み合わせることで、より詳細な反応機構の解析を進める。特に、タンパク質骨格へは遺伝子工学的手法を用いた変異アミノ酸残基の導入を行い、酵素反応においてタンパク質骨格が活性中心へ及ぼす影響の評価を進める。
さらに、本機能モデルにおけるタンパク質骨格は制御された第二配位圏として作用することが示されており、人工的に制御し、生体金属触媒への応用を検討する。具体的には反応中間体として予想される有機金属種に外部基質 (カルボニル化合物や不飽和化合物)を反応させ、タンパク質の不斉環境を利用した不斉C-C結合形成に挑戦する。本研究で得られる成果は、分子生物学的におけるメタン発生・分解酵素の反応機構・作用機序解明につながり、また、C1源の効率的変換を目指した新しいタイプの生体金属触媒構築に大きく貢献すると期待される。
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