2017 Fiscal Year Annual Research Report
The mechanism of complex formation between cytochrome c and transmembrane proteins
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17J01146
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
佐藤 航 北海道大学, 大学院総合化学院, 特別研究員(DC2)
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| Project Period (FY) |
2017-04-26 – 2019-03-31
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| Keywords | シトクロムc / 電子伝達活性 / 脱水和 / 構造変化 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
生体膜に囲まれており、かつ多様な生体分子が高濃度で混在することで水和環境が希薄溶液中と大きく異なるミトコンドリア膜間部において、どのように電子キャリアタンパク質シトクロムc(Cyt c)からシトクロムc酸化酵素(CcO)への電子移動反応を実現しているかについて種々の分光的手法を用いて検討した。
水和環境の変化がCyt cの電子伝達活性に与える影響を検討するため、タンパク質表面から脱水和を誘起するポリエチレングリコール(PEG)を溶液中に添加した系におけるCyt cの電子伝達活性の測定を試みた。その結果、PEG存在下においてCyt cの還元電位が40 mV程度ダウンシフトし、CcOを加えていない段階でCyt cが自動酸化するという予想外の結果が示された。このCyt cの自動酸化の原因となる構造変化を追跡するため、ヘムの相対配置を鋭敏に反映する蛍光共鳴エネルギー移動を用いた測定を行った結果、PEGの添加によってCyt c表面から脱水和が誘起された際、Cyt cはヘムの1Å程度の位置変化を伴う微細な構造変化が誘起されていることが示唆された。さらに、変異体Cyt cを用いた実験より、自動酸化に至る構造変化の原因となる脱水和がヘム近傍に位置する疎水性アミノ酸残基Ile81, Val83周辺からのものであることが明らかとなった。これらの疎水性残基は先行研究のCyt c-CcO複合体のドッキングシミュレーション(Sato et al., J. Biol. Chem., 2016, 291, 15320)よりCcOとの会合時に表面から脱水和が誘起されることが予測されており、Cyt cヘム近傍の水和環境変化が還元電位の低下を通してCcOへの電子伝達反応を促進している可能性が新たに提唱された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度はより生体内に近い環境下における電子キャリアタンパク質シトクロムc(Cyt c)のシトクロムc酸化酵素(CcO)への電子伝達機能について検討を行った。その結果、様々な生体分子が高濃度で混在することを想定した人口高分子ポリエチレングリコール(PEG)をCyt c溶液に添加した系において、Cyt cの還元電位の低下、さらにはヘム鉄の自動酸化など予想外の現象が観測された。そしてPEG存在下におけるこれらの現象がヘムの位置変化を伴う微細な三次元的構造変化によるものであり、その構造変化がCyt cのヘム近傍に位置する疎水性アミノ酸残基から誘起される脱水和に起因することが新たに示された。本年度の研究で観測されたCyt cの還元電位の低下などの現象が実際の生体内環境においても同様に観測されるかについては更なる検討が必要ではあるが、上記の結果は少なくとも脱水和をはじめとするCyt c表面の水和環境の変化が電子伝達機能に大きな影響を与えることを明確に示しており、CcOとの会合時に疎水性相互作用の形成に伴いCyt cヘム周辺の疎水性残基から脱水和が誘起されることの機能的意義が新たに提唱されたという点で研究がおおむね順調に進行していると考える。
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| Strategy for Future Research Activity |
次年度はCyt cに電子を供与するタンパク質複合体III(Cyt bc1)との電子伝達複合体の形成機構について検討する。まずこのタンパク質複合体の形成がCyt c-CcOの系と同様、エントロピーの増大に起因しているかを検討するため、等温滴定型熱量測定によってCyt bc1-Cyt c間の会合に伴うエンタルピー及びエントロピー変化を求める。次に、会合に伴う脱水和がエントロピーの増大にどの程度寄与しているかを検討する。脱水和した水の分子数を会合前後のタンパク質水和層の体積変化として捉え、この体積変化をCyt bc1-Cyt c複合体解離定数の浸透圧依存性から求め、脱水和の熱力学的寄与を評価する。さらに、アミノ酸残基側鎖の水和数を少なくした変異体Cyt cを用いた実験を通して、Cyt bc1との会合の際Cyt c表面から脱水和が誘起されるアミノ酸残基を同定する。以上の実験を通してCyt bc1-Cyt c複合体形成を熱力学的に駆動するアミノ酸残基間相互作用を明らかにし、電子キャリアタンパク質Cyt cによる複合体形成機構の一般性を考察する。さらに、酵母から単離したミトコンドリアを用いた電子伝達活性測定を通してCyt cと生体膜に結合した状態のCyt bc1, CcOとの複合体形成機構について検討し、これまでの研究で提唱された複合体形成機構の妥当性を考察する。
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Research Products
(2 results)
